中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法建立荔止痛方提取工藝研究

鐘遠堅，楊玉婷，潘 可，王 剛，趙立春,

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200）

本實驗采用回流提取法，以“荔止痛方”中治療睪丸炎功效成分原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷及干膏收率為指標(biāo)，選用單因素考察法、中心組合設(shè)計-效應(yīng)面法結(jié)合信息熵權(quán)法對指標(biāo)數(shù)據(jù)進行權(quán)重分析，并且對主要的影響因素：溶劑倍數(shù)、提取時間、浸泡時間以及提取次數(shù)進行優(yōu)選，力圖建立一個穩(wěn)定、可靠、最優(yōu)的“荔止痛方”生產(chǎn)提取工藝，在保證其功效的基礎(chǔ)上為后續(xù)“荔止痛方”治療睪丸炎研究提供依據(jù)[1-2]。

1 設(shè)備與材料

1.1 儀器

Waster2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）； PX124ZH 型電子分析天平 [奧豪斯儀器（常州）有限公司]；HC-1000Y型多功能粉碎機（浙江省永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）；PL-S80T型康士杰超聲波清洗機（東莞康士潔超聲波科技有限公司）；DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試藥

原兒茶酸（批號：MUST-1710908，含有量99.32%）、檸檬苦素（批號：MUST-17030620，含有量99.39%）、車葉草苷（批號：AF9112301,含有量99.78%）（成都埃法生物科技有限公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher Chemical公司）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原兒茶酸、檸檬苦素以及車葉草苷含有量測定

2.1.1 對照品母液配制 精密稱取原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷對照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得（三者質(zhì)量濃度分別為1.040 mg·mL-1、1.050 mg·mL-1、1.10 mg·mL-1）。

2.1.2 供試液配制 稱取“荔止痛方”全方藥材，共45 g，置于燒瓶中，加水浸泡后，加熱回流提取2次后，合并濾液后，用200目濾布過濾，離心10 000 rpm，3 min；過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈～0.1%磷酸；體積流量1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測波長：260 nm（0～25 min）、239 nm（26～70 min）、203 nm（71～120 min）；柱溫：30 ℃。色譜方法見表1，色譜圖見圖1。

表1 HPLC色譜方法

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察[3-7]精密吸取原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷對照品母液，分別逐步稀釋于5個5 mL棕色量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，在“2.1.1”項條件下進樣10 μL測定。濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，得回歸方程分別為原兒茶酸：Y= 29 836X+522.1（r2= 0.999 8），線性范圍0.52～2.60 μg；檸檬苦素：Y=4 534.1X-5 807.9（r2= 0.999 4），線性范圍21.00 ～ 105.00 μg；車葉草苷：Y= 7 862.5X+3 075.6（r2= 0.999 5），線性范圍3.14～15.70 μg。

2.1.5 精密度試驗[3-7]取同一對照品溶液，在“2.1.1”項下進樣測定6次，每次10 μL，測得原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷峰面積RSD分別為0.60%、0.60%、0.70%，說明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗[3-7]配制供試液1份，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h 在“2.1.1”項進樣測定，測得原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷峰面積RSD分別為0.74%、1.16%、0.89%，表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗[3-7]按照“2.1.3”方法，同法配制6份供試液，在“2.1.1”項下進樣測定，測得原兒茶酸、檸檬苦素和車葉草苷峰面積RSD分別為1.26%、1.91%，1.85%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.8 加樣回收率試驗[3-7]配制成分含量已知的供試液9份，精密加入樣品含量一半的80%、100%、120%對照品母液，在“2.1.1”項下進樣測定，計算回收率。測得原兒茶酸含量平均加樣回收率為99.98%，RSD為2.02%；檸檬苦素含量平均加樣回收率為99.44%，RSD為2.23%；車葉草苷含量平均加樣回收率為100.27%，RSD為2.37%。

2.2 干膏收率測定

取一定量藥液，置于已恒重的稱量瓶（M1）中，105 ℃烘箱中再次恒重，記錄重量（M2），前后重量之差÷藥材總量（M）×100%，即得。

2.3 單因素試驗

2.3.1 溶劑倍數(shù)的考察 固定提取時間為90 min，浸泡時間為45 min，提取2次，改變?nèi)軇┍稊?shù)，觀察其對原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷以及干膏收率的綜合評分的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 溶劑倍數(shù)與指標(biāo)綜合評分的關(guān)系

由圖2可知，在溶劑倍數(shù)為9～15倍的范圍內(nèi)，綜合評分隨著溶劑倍數(shù)的增加而提高，在15倍數(shù)時最高，為2.93；在這個范圍內(nèi)，綜合評分直線上升，說明溶劑倍數(shù)對于提取工藝影響較大。15～21倍的范圍內(nèi)，綜合評分總體持平，但不明顯。三個試驗誤差線相互重疊，原因可能是用大約15倍左右水提取2次，已經(jīng)基本完成了對于藥效成分的全部提取，因此即使隨著溶劑倍數(shù)不斷提高，在藥效成分已經(jīng)最大限度被提取的情況下，指標(biāo)成分變化不大，故出現(xiàn)基本持平。即判斷在12～18倍數(shù)之間，可能出現(xiàn)最高藥效成分含量的拐點，提供了響應(yīng)面可選的水平范圍。

2.3.2 提取時間的考察 固定浸泡時間為45 min，溶劑倍數(shù)為15倍，提取2次，改變提取時間，觀察其對原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷以及干膏收率的綜合評分的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間與指標(biāo)綜合評分的關(guān)系

由圖3可知，在30～150 min范圍內(nèi)，指標(biāo)綜合評分整體呈現(xiàn)上升趨勢。在30～90 min時間段與在90～150 min時間段相比，上升趨勢較快。推測可能原因為，在前90 min提取時間內(nèi)，藥效成分已經(jīng)大部分被提取出來，上升較快；因此90～150 min范圍內(nèi)，只是小部分的藥效成分被緩慢提取，上升減緩。總體指標(biāo)綜合評分仍然在不斷上升，說明藥效成分還未提取完全；曲線上升趨勢減緩，說明可能已經(jīng)出現(xiàn)了藥效成分提取效率最高的時間90～150 min范圍內(nèi)，雖然指標(biāo)綜合評分不斷上升，但提取效率相對前90 min較低。即判斷在60～120 min之間，可能出現(xiàn)了指標(biāo)成分提取效率高低的拐點，提供了響應(yīng)面可選的水平范圍。

2.3.3 浸泡時間的考察 固定提取時間為90 min，溶劑倍數(shù)為15倍，提取2次，改變浸泡時間，觀察其對原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷以及干膏收率的綜合評分的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 浸泡時間與指標(biāo)綜合評分的關(guān)系

如圖4可知，在15～30 min范圍時，指標(biāo)綜合評分隨著浸泡時間而增長；在30～75 min范圍內(nèi)，隨著浸泡時間不斷增加，指標(biāo)綜合評分并未出現(xiàn)明顯繼續(xù)上升趨勢。推測可能原因為，在45 min前，已經(jīng)完成將藥材浸透的目的，故在45 min后浸泡時間繼續(xù)增加，對指標(biāo)綜合評分影響不大。即判斷在15～45 min之間，可能出現(xiàn)拐點，提供了響應(yīng)面可選的水平范圍。

2.3.4 提取次數(shù)的考察 固定提取時間為90 min，浸泡時間為45 min，溶劑倍數(shù)為15倍，改變提取次數(shù)，觀察其對原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷以及干膏收率的綜合評分的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 提取次數(shù)與指標(biāo)綜合評分的關(guān)系

由圖5可知，提取次數(shù)為1～3時，隨著提取次數(shù)增加，指標(biāo)綜合評分持續(xù)上升。第3次、第4次相比，提取指標(biāo)綜合評分不再繼續(xù)上升。推測可能原因為在經(jīng)過3次提取之后，藥效成分已基本提取完全，繼續(xù)增加提取次數(shù)，已經(jīng)沒有更多的藥效成分提出。因此，確定提取次數(shù)為3次。

2.4 中心組和設(shè)計-響應(yīng)面法（CCD）

在單因素試驗基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)A（溶劑倍數(shù)）、B（提取時間）、C （浸泡時間）三個因素對提取工藝的影響較大，故選擇這三個因素進一步進行中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，因素范圍分別為A（12～21倍）、B（60～120 min）、C（15～75 min），進行3因素5水平中心組合試驗設(shè)計。每個試驗分別計算4個指標(biāo)的歸一值“OD”，以其綜合評分作為該試驗的總評“OD”，總評OD=各指標(biāo)歸一值×權(quán)重系數(shù)之和。因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設(shè)計及結(jié)果

2.5 信息熵權(quán)法[8-9]

對于某項指標(biāo)而言，可以用熵值來判斷某個指標(biāo)的離散程度，其信息熵值越小，指標(biāo)的離散程度越大，說明該指標(biāo)越重要；反之，該指標(biāo)越不重要。計算得出原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷、干膏收率的權(quán)重系數(shù)依次為0.238 0，0.254 2，0.255 8，0.252 0。

2.6 模型擬合及顯著性分析

應(yīng)用 Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得回歸方程Y= 0.84+0.033A+0.12B+0.039C+0.067AB+0.055AC+0.027BC-0.12A2-0.11B2-0.19（r= 0.985 3），表明模型擬合度良好，誤差較小，方差分析見表4。由表4可知，整體模型（P＜0.000 1），有顯著性差異；失擬項（P＞0.05），失擬不顯著，說明回歸方程的擬合程度和可信度均較好。因素A （溶劑倍量）影響顯著（P＜0.05），B（提取時間） 極顯著（P＜0.000 1），C （浸泡時間）極顯著（P＜0.01），影響程度依次為B＞C＞A。交互項AB、AC影響顯著 （P＜0.05）；BC不顯著 （P＞0.05）；二次項A2、B2、C2極顯著。

2.7 模型預(yù)測與修正

見圖6。由此可知，預(yù)測最優(yōu)工藝為：溶劑倍量為18.16，提取時間為110.56 min，浸泡時間為51.23 min，提取3次，總評OD值為0.894?？紤]實際生產(chǎn)成本等因素，最終將其修正為18倍量水，浸泡51 min，提取110 min，提取3次。

圖6 各因素響應(yīng)面圖

2.8 驗證試驗

稱取“荔止痛方”全方藥材，共45 g，按“2.7”項下最優(yōu)工藝進行3批驗證試驗。優(yōu)選工藝結(jié)果顯示，在修正后提取工藝下，功效成分以及干膏收率的綜合評分均較高，并且相近，提示修正后的提取工藝是適宜、穩(wěn)定、可靠的。結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果（n= 3）

3 討論

原兒茶酸、檸檬苦素以及車葉草苷均有紫外吸收，但其最大紫外吸收波長不同，結(jié)合實驗需要，實驗采用多波長同時掃描測定，保證三種指標(biāo)成分在各自最大紫外吸收波長條件下，出現(xiàn)在同一色譜圖上。信息熵權(quán)法常用于多指標(biāo)成分的綜合評價，其從數(shù)據(jù)分布上分析客觀反應(yīng)了指標(biāo)的權(quán)重大小，本研究采用該方法較為客觀的反應(yīng)了原兒茶酸、檸檬苦素、車葉草苷以及干膏收率的權(quán)重系數(shù)的大小[10-11]。

對于中藥活性成分提取來說，溶劑倍數(shù)、提取時間、浸泡時間、提取次數(shù)、中藥材前處理、提取溫度等共同影響著藥效成分的提取。對于中藥材的前處理，在實驗設(shè)計之初，考慮將荔枝核粉碎后提取，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，將荔枝核粉碎后提取，容易出現(xiàn)糊化現(xiàn)象，并分析推測可能由于荔枝核淀粉、多糖等大分子物質(zhì)導(dǎo)致，故未將荔枝核粉碎后提取。加上本方分別包含種子類和草本中藥材，已有報道兩類中藥材所需浸泡時間相差較大，因此將浸泡時間優(yōu)先設(shè)置為重要考察因素。在預(yù)實驗，本研究對于常規(guī)提取工藝中的重要因素提取溫度也進行了考察，最高溫度設(shè)置為100 ℃，曲線呈直線上升趨勢。結(jié)合生產(chǎn)成本等考慮，就將溫度定為100℃。

單因素考察試驗后發(fā)現(xiàn)，藥材的活性成分含量有限，在一定范圍內(nèi)，藥效成分能被快速、大量的提取出來；而超過這個范圍后，提取效率急劇下降。溶劑倍數(shù)、提取時間、浸泡時間對指標(biāo)綜合評分影響較大；提取3次之后，對于指標(biāo)綜合評分幾乎無影響。單因素考察限定于單個因素對于整個提取工藝的影響，很難再進一步同時對幾個因素的整體作用進行分析。因此，單因素考察之后，采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法（CCD）進一步研究各個因素之間的協(xié)同或者拮抗關(guān)系。CCD結(jié)果可知，回歸方程擬合程度、可信度較好，提取工藝最優(yōu)的預(yù)測條件為：溶劑倍數(shù)為18倍、提取時間為110 min、浸泡時間為51 min，提取3次。3批次驗證實驗結(jié)果證明，該工藝是適宜、穩(wěn)定、可靠的。

通過建立穩(wěn)定、可靠、最優(yōu)的“荔止痛方”提取工藝為后續(xù)進一步開展藥效試驗研究提供依據(jù)。