忍冬葉不同溶劑提取物與抗氧化的譜效關(guān)系研究

南敏倫，尹 涵，司學(xué)玲，張瀚水，林宇琪，馬春霞，趙昱瑋，赫玉芳*

（1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118；3.修正藥業(yè)集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，長(zhǎng)春 130012；4.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130021；5.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）法，建立忍冬葉11種不同溶劑提取物的指紋圖譜，通過(guò)與對(duì)照品、文獻(xiàn)信息比對(duì)指認(rèn)共有峰對(duì)應(yīng)的化合物，再結(jié)合各提取物抗氧化活性，通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度法（GRA）和偏最小二乘法（PLS）聯(lián)合分析共有峰與抗氧化活性的譜效關(guān)系，旨在為忍冬葉抗氧化的藥效物質(zhì)研究提供參考，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)忍冬葉提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100 series LC-MSD 型液質(zhì)聯(lián)用儀，包括Agilent SL 型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、Chemistation化學(xué)工作站等（美國(guó)Agilent公司）；QUINTIX35-1CN型十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯公司）；iMark型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)公司）；DR3900 臺(tái)式分光光度計(jì)（美國(guó)HACH）。

1.2 藥品與試劑

忍冬葉藥材（批號(hào)：210501）購(gòu)自安國(guó)振國(guó)中藥材有限公司，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成研究員鑒定其為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb）的干燥葉；馬錢(qián)苷、綠原酸、3,4-二羥基肉桂酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素對(duì)照品（批號(hào)分別為111640-201707、110753-201817、110885-201602、100080-201408、111720-201810、111521-201704、100081-201706、111520-201605，純度：≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 忍冬葉不同極性提取物制備

稱(chēng)取忍冬葉藥材，分別用8倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇和蒸餾水，提取2次，每次1 h，濾過(guò)，分別合并提取液，濃縮，干燥，即得6種忍冬葉提取物，記為S1～S6。另稱(chēng)取忍冬葉藥材，依次用8倍量95%乙醇、75%乙醇各提取2次，每次1 h，濾過(guò)，合并提取液，濃縮，加水至每毫升含2 mg藥材，再依次用石油醚（30～60 ℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇振搖提取，將上述4種濾液和振搖提取后的水相分別回收，干燥，即得5種忍冬葉提取物，記為S7～S11[1]。

2.2 忍冬葉提取物指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Alphasil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～15 min 7%A，15～50 min 7%A→ 25%A，50～ 70 min 25%A→ 35%A，70～ 90 min 35%A→ 55%A，90～ 95 min 55%A→7%A，95～100 min 7%A；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 以HESI為離子源；負(fù)離子檢測(cè)；掃描范圍為m/z 100～1 500；傳輸管溫度為350 ℃，輔助氣溫度為450 ℃；碰撞能量為30 eV；檢測(cè)方式為Full-MS/dd-MS2； dd-MS2分辨率為35 000。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取上述11種提取物，研細(xì)，各0.1 g，分別置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解，濾過(guò)，即得各供試品溶液。

2.2.4 對(duì)照品混合溶液的制備 分別精密稱(chēng)取馬錢(qián)苷、綠原酸、3,4-二羥基肉桂酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.1、0.01、0.005、0.05、0.01、0.005、0.005 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.5 儀器精密度試驗(yàn) 取70%忍冬葉乙醇提取物制備的供試品溶液（編號(hào)：S3），按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄20個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.86%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.88%（n= 6），表明本儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取忍冬葉70%乙醇提取物制備的供試品溶液（編號(hào)：S3），按色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄20個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.65%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.76%（n= 6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取忍冬葉70%乙醇提取物（編號(hào)：S3），共6份，制備得到6份供試品溶液，按色譜條件測(cè)定，記錄20個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.59%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.76%（n= 6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 指紋圖譜生成及特征峰確認(rèn) 取“2.2.3”項(xiàng)下制備的11種忍冬葉提取物的供試品溶液，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，得總離子流圖。將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012年版）中，以 S3為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.2 min，圖譜間距為20 mV，選擇中位數(shù)法，生成11種提取物指紋圖譜的共有模式見(jiàn)圖1，各共有峰峰面積見(jiàn)表1。根據(jù)各色譜峰的準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，并通過(guò)與對(duì)照品、化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)信息[2-4]比對(duì)指認(rèn)忍冬葉中的化學(xué)成分。結(jié)果，11種忍冬葉提取物中有共有峰20個(gè)，化學(xué)成分指認(rèn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 忍冬葉不同極性提取物共有峰蜂面積實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 忍冬葉提取物中化學(xué)成分的分析結(jié)果

圖1 11種忍冬葉提取物色譜峰共有模式圖

2.3 忍冬葉提取物抗氧化作用

2.3.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 配制含DPPH 0.04 mg·mL-1的乙醇溶液和不同濃度忍冬葉各提取物溶液（0.05，0.1，0.25，1.0，2.0，4.0，8.0 mg·mL-1）。分別取不同濃度的各忍冬葉提取物溶液80 μL，分別加入200 μL 上述DPPH溶液，密閉、室溫、避光條件下反應(yīng) 20 min后，在520 nm 下測(cè)定吸光值，以DPPH 溶液為空白對(duì)照組，按公式計(jì)算清除率： 清除率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值÷空白組OD值）×100%，試驗(yàn)重復(fù)3次。以不同質(zhì)量濃度各忍冬葉提取物濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，得到線性方程，計(jì)算其IC50值，以IC50值作為評(píng)價(jià)各忍冬葉提取物抗氧化強(qiáng)弱的指標(biāo)[5]。

2.3.2 總還原能力的測(cè)定 取1.0 mL不同濃度的各忍冬葉提物溶液（0.5，1，2，4，8，12，16 mg·mL-1），依次加入pH = 6.6的0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液2.5 mL的和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，置50 ℃條件下保溫20 min 后置冰水中冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，離心（4 000 r·min-1）8 min，取5.0 mL上清液，依次加入去離子水 5.0 mL和0.1%三氯化鐵溶液1.0 mL，靜置10 min，以去離子水為空白對(duì)照，在700 nm 處測(cè)吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3次。以不同質(zhì)量濃度各忍冬葉提取物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到線性方程，計(jì)算其IC50值[6]。

由表3結(jié)果顯示，在 0.05～8.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，各忍冬葉提取物對(duì) DPPH 自由基均具有清除作用，其中S9組的活性最強(qiáng)，其 IC50值為（1.08±0.15） mg·mL-1，活性最差的為S11組，其 IC50值為 （8.04±0.18） mg·mL-1；不同組別忍冬葉提取物隨濃度增加其清除自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。由于抗氧化劑具有強(qiáng)的還原能力，可以將體內(nèi)的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵，增強(qiáng)血紅蛋白對(duì)氧的運(yùn)輸能力，可以與自由基反應(yīng)。在 0.5～16 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，不同組別忍冬葉提取物均具有較強(qiáng)的還原能力，其中S9組的活性最強(qiáng)，其 IC50值為（3.41±0.10） mg·mL-1，活性最差的為S11組，其 IC50值為 （13.58±0.16） mg·mL-1；表明忍冬葉提取物可作為抗氧化劑提供電子，具有較強(qiáng)還原性。

表3 各組清除DPPH 自由基、還原能力的試驗(yàn)結(jié)果

2.4 忍冬葉化學(xué)成分與抗氧化的譜效分析

2.4.1 GRA 利用DPS-3.01軟件，根據(jù)忍冬葉各提取物清除DPPH 自由基IC50及還原力IC50計(jì)算的活性數(shù)據(jù)，加權(quán)系數(shù)均為0.5。將各共有峰峰面積與抗氧化活性數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，計(jì)算其關(guān)聯(lián)度，得到各峰對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)高低[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20個(gè)共有峰與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度均＞0.8，其排名前九位的共有峰分別為：峰5＞4＞16＞17＞18＞20＞19＞1＞9，見(jiàn)表4。

表4 忍冬葉提取物中20個(gè)共有峰與抗氧化的GRA分析結(jié)果

2.4.2 PLS 利用SIMCA-11軟件，經(jīng)過(guò)多次提取主成分，多次迭代，擬合出20個(gè)共有峰對(duì)抗氧化的貢獻(xiàn)程度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)[8-9]，見(jiàn)表5。

表5 忍冬葉提取物中20個(gè)共有峰與抗氧化活性的PLS分析結(jié)果

由表4結(jié)果可知，其各成分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)程度與GRA的分析結(jié)果基本一致。除峰8、6、10、11呈負(fù)相關(guān)外，其余各峰均與抗氧化活性的回歸系數(shù)均大于0，成正相關(guān)，排名前九位的共有峰分別為：峰5＞4＞16＞18＞17＞19＞20＞1＞9，與GRA結(jié)果基本一致。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，忍冬葉中主要成分是酚酸類(lèi)及黃酮類(lèi)成分，此外還有少量的萜類(lèi)、苷類(lèi)、揮發(fā)油、生物堿等多種成分。由于化學(xué)成分類(lèi)別的多樣性，提取方法也較多，通常情況下回流提取能有效的提取其中的化學(xué)成分，本研究選擇了回流提取法。不同類(lèi)化學(xué)成分在不同極性溶劑中的溶解性具有明顯差異，揮發(fā)油易溶于石油醚中，生物堿溶于三氯甲烷中，酚酸類(lèi)、黃酮苷元溶解于高濃度乙醇或乙酸乙酯中，黃酮苷、皂苷易溶解于低濃度乙醇或正丁醇中，多糖溶于水中，為了盡可能的將各類(lèi)成分均提取出來(lái)，選擇了本研究中提取方法，提取得到了11種提取物。

對(duì)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，11種忍冬葉提取物對(duì) DPPH 自由基均具有清除作用，其中乙酸乙酯提取物的活性最強(qiáng)，其 IC50值為（1.08±0.15）mg·mL-1，活性最差的為經(jīng)過(guò)不同溶劑萃取后的水提取物，其IC50值為（8.04±0.18）mg·mL-1；11種忍冬葉提取物隨濃度增加其清除自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。11種忍冬葉提取物均具有較強(qiáng)的還原能力，其中乙酸乙酯提取物的活性最強(qiáng)，其 IC50值為（3.41±0.10）mg·mL-1，活性最差的為不同溶劑萃取后的水提取物，其 IC50值為（13.58±0.16）mg·mL-1，表明忍冬葉提取物可作為抗氧化劑提供電子，具有較強(qiáng)還原性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其中乙酸乙酯提取物抗氧化作用最強(qiáng)。

本研究分析了忍冬葉11種提取物中20個(gè)化學(xué)成分，通過(guò)譜效分析確定了其中具有抗氧化活性的主要化學(xué)成分可能為峰 5、4、16、17、18、20、19、1、9，即3,4-二羥基肉桂酸、綠原酸、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素、槲皮素、5-咖啡酰奎寧酸、4-咖啡酰奎寧酸，主要為酚酸類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物，研究結(jié)果提示忍冬葉抗氧化活性可能與上述物質(zhì)相關(guān)。由于酚類(lèi)物質(zhì)及黃酮類(lèi)化合物含有一個(gè)或者多個(gè)酚羥基，這些酚羥基的存在使之具有良好的抗氧化活性[10]。盡管有文獻(xiàn)[11]報(bào)道忍冬中三萜類(lèi)和多糖類(lèi)成分亦具有一定的抗氧化活性，但與其中的酚類(lèi)成分比較，抗氧化活性相對(duì)較弱。本研究印證了忍冬葉中抗氧化活性成分主要為酚酸類(lèi)及黃酮類(lèi)成分，同時(shí)明確了各成分抗氧化活性的強(qiáng)弱，對(duì)闡明忍冬葉抗氧化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，建立忍冬葉多指標(biāo)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有明顯的積極意義，對(duì)于忍冬葉藥材的有效開(kāi)發(fā)和利用具有重要的參考價(jià)值，對(duì)于天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)具有重要的理論參考和實(shí)際意義。