BA-ELISA法對食品中克百威殘留的高效測定

朱文博，趙凌燕，王敏思，宋 洋

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

克百威（carbofuran）屬于氨基甲酸酯類殺菌劑，具有高效、低殘留的特點以及內(nèi)吸、觸殺、胃毒等一定的殺卵作用，可防治多種害蟲、螨類和線蟲，還可通過縮短作物生長期來提高作物產(chǎn)量，因此以往被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[1].近年來克百威被限制使用：一方面，由于克百威的持效期和半衰期較長，因此易造成環(huán)境污染；另一方面，克百威會使膽堿酯酶失活，造成機體組織中乙酰膽堿大量蓄積從而導(dǎo)致中毒[2].我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2016）[3]中規(guī)定了克百威的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中水果的最大殘留限量（MRL）不得超過0.02 mg/kg.歐盟規(guī)定蘋果和柑橘類水果中克百威的MRL分別為0.001和0.01 mg/kg[4].但目前仍有生產(chǎn)者將克百威作為隱性成分非法添加到農(nóng)藥產(chǎn)品中，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中的克百威超標(biāo)，嚴(yán)重危害農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全.

現(xiàn)今常用的克百威殘留分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）及酶聯(lián)免疫法（ELISA）等.儀器方法雖然可以準(zhǔn)確測定多種藥物，但繁瑣費時，需要復(fù)雜的樣品前處理過程、昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，檢測成本高，難以滿足現(xiàn)場快速檢測樣品的需要.酶聯(lián)免疫吸附測定法由于具有特異性強、檢測成本低等優(yōu)勢，適用于復(fù)雜體系基質(zhì)中痕量組分的分離或檢測，已成為許多國家檢測農(nóng)藥殘留的首選方法.近年來，已有一些針對果汁、茶葉、水果等農(nóng)產(chǎn)品中克百威殘留快速檢測研究的報道，如Mickova等[5]基于單克隆抗體建立了酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（HPLC/ESI/MS/MS）法，測定嬰兒水果食品中的克百威、西維因和甲硫威，ELISA中克百威的方法檢測限（LOD）為0.3 μg/kg，樣品的添加回收率為60%～100%，檢測時間在4 h以內(nèi)；何方洋等[6]基于篩選的克百威單克隆抗體，建立了間接競爭ELISA方法檢測蔬菜及茶葉中的克百威殘留，檢測限分別為10 μg/L和5 μg/L，半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為2.3 μg/L，加標(biāo)回收率為79.2%～102.7%，檢測時間僅為1.5 h；Lan等[7]基于廣譜特異性單克隆抗體建立了可同時檢測水果和蔬菜中克百威與3-羥基克百威的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法，檢測限為0.03 μg/L，IC50為0.76 μg/L，檢測時間約為2.5 h，相較于其他方法，該方法檢測限更低，能更好地滿足實驗室食品樣品中克百威含量的檢測要求.

為了獲得更為簡單、快速、高效、靈敏的檢測方法，本研究基于單克隆抗體建立了間接競爭生物素/親和素酶聯(lián)免疫分析方法（biotin/avidin-enzyme-linked immunosorbent assay，BA-ELISA），消除食品樣品中基質(zhì)的影響并且對前處理方法進行優(yōu)化，使其更加簡單、快捷、準(zhǔn)確，從而實現(xiàn)水果及水果制品中克百威殘留的高效檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：全波長酶標(biāo)儀（Labsystems），美國雷勃公司；96孔酶標(biāo)板，丹麥Nunc公司.

試劑：克百威、克百威抗原、單克隆抗體，山東華陽農(nóng)藥化工集團有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（SA-HRP）、生物素化羊抗兔IgG（B-Ab2）、過氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），美國Sigma公司.

1.2 間接競爭BA-ELISA方法

向酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加入100 μL經(jīng)包被液（pH值為9.6的碳酸鈉緩沖液）適當(dāng)稀釋的抗原，室溫下包被過夜（或37℃包被3 h）.棄去孔內(nèi)溶液，利用洗液（1 L PBS+0.5 g吐溫）洗板3次，加入200 μL封閉液（含0.5%脫脂奶粉的PBS），室溫下封閉1 h，棄封閉液，洗板3次，加入待測樣（或梯度稀釋的標(biāo)樣）和抗體各100 μL，同時設(shè)置空白組（不加標(biāo)樣或待測樣以及抗體）和對照組（不加標(biāo)樣或待測樣），37℃孵育20 min，洗板4次.每孔加100 μL稀釋后的IgG（B-Ab2），37℃孵育20min，洗板4次.每孔加100 μL稀釋后的SA-HRP，37℃孵育10 min，洗板5次.每孔中加150 μL現(xiàn)配制的底物，顯色20 min，利用酶標(biāo)儀讀取A450和A650.

將包被原稀釋，使每孔中的質(zhì)量分別為0.1、0.5和1.0 μg.用離子濃度分別為10、20、30 mmol/L，pH值分別為5.5、6.5、7.4、8.5的磷酸鈉緩沖液稀釋生物素化羊抗兔抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素及克百威標(biāo)準(zhǔn)品，孵育時間分別設(shè)為30、45、60 min，利用酶標(biāo)儀讀取A450和A650，計算IC50以確定最佳條件.

配制含量分別為0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00 μg/L的克百威標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用BA-ELISA對其進行測定.以克百威標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg/L）為橫坐標(biāo)，以抑制率（%）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

式中：A空白為空白孔的吸光度；A對照和Ax為含量分別為0和x時克百威標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度.

1.3 抗體特異性評價

以交叉反應(yīng)率（CR）作為評判抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)[8].

式中：IC50(克百威)為克百威抑制率為50%時對應(yīng)的克百威含量；IC50(其他標(biāo)準(zhǔn)品)為其他標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率為50%時對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品含量.

1.4 樣品測定

1.4.1 樣品處理

選用蘋果、蘋果汁、橙子、橙汁作為樣品來評估間接競爭BA-ELISA法的性能和指標(biāo)，水果及水果制品均來自于市售.

水果樣品：稱取2.0 g粉碎后的樣品，向其中加入4 mL乙腈和1 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，離心5 min（4 000 r/min），吸取2 mL上清液進行旋蒸，加入1 mL甲醇復(fù)溶，置于4℃下儲存?zhèn)溆?

果汁樣品：取2 mL樣品，加入4 mL乙腈和1 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min，離心5 min（4 000 r/min），吸取2 mL上清液進行旋蒸，加入1 mL甲醇復(fù)溶，置于4℃下儲存?zhèn)溆?

1.4.2 消除基質(zhì)影響

為了減少基質(zhì)的影響，將處理好的樣品提取液分別用添加了魚皮膠（FG）、牛血清蛋白和表面活性劑等基質(zhì)掩蔽劑的PBS稀釋液進行處理，再采用BA-ELISA法進行測定[9].

1.4.3 添加回收實驗

本研究通過對蘋果、蘋果汁、橙子、橙汁4種樣品進行加標(biāo)回收實驗來評價BA-ELISA方法的準(zhǔn)確度.樣品提取液分別添加不同質(zhì)量的克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其終含量分別為10、20和40 μg/kg（每個含量重復(fù)3次），進行BA-ELISA實驗并計算回收率.

1.4.4 盲樣檢測

取4種水果及其制品共12件空白樣品，編號1#～12#，隨機添加克百威標(biāo)準(zhǔn)品制成盲樣用于BA-ELISA和氣相色譜法（GC）檢測.

1.4.5 方法比對實驗

檢測方法參考文獻[10]，樣品提取方法同1.4.1，處理后的樣品提取液過0.22 μm有機濾膜，之后用氣相色譜法進行檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 BA-ELISA方法的建立

對抗原包被量、PBS緩沖液的濃度和pH值、稀釋倍數(shù)、孵育時間等條件進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件為：包被原的包被量為每孔0.5 μg，緩沖液濃度為10 mmol/L、pH值為7.4，IgG（B-Ab2）和SA-HRP均稀釋5 000倍，IgG（B-Ab2）孵育時間為20 min，SA-HRP孵育時間為10 min.繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可得，IC15=（0.082±0.002）μg/L，IC50=（0.265±0.010）μg/L，線性范圍為0.12～2.10 μg/L.通過該方法得到的克百威檢出限遠低于我國及一些歐盟國家所規(guī)定的MRL值.

圖1 克百威抑制曲線Fig.1 Carbofuran inhibition curve

2.2 特異性評價

選擇與克百威結(jié)構(gòu)類似的其他化合物進行交叉反應(yīng)率測試，從而對抗體特異性進行評價，結(jié)果如表1所示.

表1 各化合物與抗體的IC50和CR值Tab.1 IC50 and CR of some compounds with antibody

由表1可以看出，同屬于氨基甲酸酯類殺菌劑的異丙威、速滅威、滅多威和甲萘威的交叉反應(yīng)率均低于0.01%，說明實驗中的抗體具有很好的特異性，能夠?qū)Ｒ恍詸z測克百威.抗體與丁硫克百威的交叉反應(yīng)率為0.02%，可能是由于丁硫克百威容易降解為克百威，因此對抗體有一定的親和性.

2.3 克百威BA-ELISA的校正曲線及基質(zhì)曲線

經(jīng)過優(yōu)化，最終確定使用0.5%的FG-PBS緩沖液對處理后的水果及果汁樣品提取液稀釋20倍，采用BA-ELISA方法進行測定，所得抑制率曲線即為樣品的基質(zhì)曲線，如圖2所示.

圖2 克百威BA-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 BA-ELISA calibration curve of Carbofuran

由圖2可以看出，4種樣品的基質(zhì)曲線及吸光值曲線基本上能和標(biāo)準(zhǔn)曲線重合，說明該樣品前處理方法能夠基本消除基質(zhì)影響.

2.4 添加回收實驗

分別在蘋果、蘋果汁、橙子、橙汁的20倍稀釋樣品提取液中添加克百威標(biāo)品，使其最終含量分別為10.00、20.00和40.00 μg/kg，每組設(shè)置3個平行，分別采用BA-ELISA方法和GC方法進行檢測，通過計算OD值得到回收率，結(jié)果如表2所示.

表2 克百威在4種樣品中的添加回收率Tab.2 Recovery of Carbofuran in four kinds of samples

由表2可知，4種樣品采用BA-ELISA方法得到的克百威添加回收率為90.20%～99.83%，變異系數(shù)（CV）為1.8%～6.3%，同GC方法得到的結(jié)果基本一致.

2.5 盲樣檢測結(jié)果

將蘋果、蘋果汁、橙子、橙汁4種水果及其制品共12件空白樣品編號為1#～12#，隨機添加克百威標(biāo)準(zhǔn)品制成盲樣，采用本研究建立的間接競爭BA-ELISA法檢測克百威含量，以GC法檢測結(jié)果作為對照，如表3所示.由表3可知，最終檢測出陽性樣品共5件，其中蘋果2件、蘋果汁1件、橙子2件，其檢測結(jié)果與GC方法檢測結(jié)果基本一致.

表3 分別采用BA-ELISA和GC方法得到的盲樣中克百威的含量Tab.3 Carbofuran content in blind samples detected by BA-ELISA and GC method respectively

3 結(jié)論

本研究基于克百威單克隆抗體建立了簡單、高效、靈敏的BA-ELISA方法，可用來檢測水果及其制品中的克百威殘留.樣品僅需經(jīng)過乙腈提取，提取液用0.5%的FG-PBS稀釋20倍即可基本消除基質(zhì)影響.采用BA-ELISA方法對樣品進行檢測，檢測時間只需1 h，實現(xiàn)了對克百威殘留的快速、高效檢測.本實驗所建立的BA-ELISA方法檢測限為（0.082±0.002）μg/L，靈敏度為（0.265±0.010）μg/L，水果及其制品的最低檢出限是0.25 μg/kg，遠低于我國及一些歐盟國家所規(guī)定的MRL（0.02 mg/kg）的標(biāo)準(zhǔn).以GC方法作為對照，BA-ELISA方法對水果及其制品中克百威含量的檢測結(jié)果與其基本一致，證實該方法準(zhǔn)確可靠.與常用方法相比，BA-ELISA法所需時間更短，檢出限更低，可作為一種高效靈敏準(zhǔn)確的水果及其制品中克百威殘留的檢測手段.