普通絲瓜GH3基因家族全基因組鑒定及表達分析

曾美娟， 劉建汀， 李祖亮， 陳敏氡， 葉新如， 王 彬， 朱海生， 溫慶放

(1.福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省農業科學院作物研究所/福建省蔬菜工程技術研究中心，福建福州 350013；2.福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建福州 350003)

生長素是一種重要的植物激素，是最早被發現的能促進植物生長的激素，其在植物生長過程的多個重要環節中發揮著關鍵作用。植物體內的生長素在自由態和束縛態2種形式間的轉化是體內生長素水平的自我調節功能，對植物生長的調控具有重要意義。在植物生長素響應信號通路中，有3類早期生長素響應基因家族[Aux/IAAs(auxin/indole-3-acetic acids)、GH3s(gretchen hagen 3)、SAURs(small auxin upRNAs)]能快速特異地表達反應。其中，基因家族能夠催化游離態的吲哚-3-乙酸(IAA)與多種氨基酸結合，生成IAA-氨基酸復合物，將游離IAA 轉化為復合態的IAA，可以參與生長素的穩態調控，進而參與調控植物的多個生理過程，其對整個基因家族的研究具有重要意義。

普通絲瓜[(L.) Roem.]是我國主要的瓜類蔬菜之一，其肉質清香軟滑，既富含營養，又具有清熱化痰、涼血解毒等保健作用，倍受各地區消費者喜愛。基因對植物的生長發育具有重要的調控作用，但在普通絲瓜中關于基因家族的研究鮮有報道。因此，本研究以普通絲瓜為試驗材料，基于普通絲瓜全基因組對基因家族成員進行鑒定、生物信息學分析，并分析其在普通絲瓜長果品種、短果品種中的表達情況，對后續研究普通絲瓜果實發育和果實果長等具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 數據來源

普通絲瓜的基因組數據從國家基因庫生命大數據平臺(https：//db.cngb.org/)上獲取。本研究所用轉錄組數據為普通絲瓜長果品種(花后 12 d)和短果品種(花后12 d)的轉錄組數據，絲瓜樣品為2021年種植于福建省農業科學院試驗基地的試驗材料。普通絲瓜長果樣品、短果樣品分別混合取樣，試驗設置3個生物學重復，絲瓜樣品用液氮速凍后于-80 ℃保存，用于RNA-seq分析。

1.2 普通絲瓜基因組中GH3基因家族成員的鑒定及理化性質分析

通過Pfam數據庫(http：//pfam.xfam.org/)獲得GH3保守結構域的HMM模型(PF03321)，并用TBtools軟件進行simple HMM search，對普通絲瓜的基因組蛋白序列進行搜索，獲得初篩蛋白序列。再通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站進一步驗證初篩獲得的候選蛋白結構域，獲得確定的成員后，根據普通絲瓜的拉丁名(L.) Roem，將普通絲瓜編碼上述蛋白的基因定為基因。通過ProtParam在線分析網站分析普通絲瓜LcGH3蛋白的理化性質。

1.3 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白保守結構域的分析

利用NCBI保守結構域在線分析網站和MEME在線分析網站進行普通絲瓜GH3蛋白的保守結構域與基序(Motif)分析，并用TBtools軟件繪制示意圖。

1.4 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白系統進化樹的構建

為探究普通絲瓜基因家族成員蛋白的進化關系，從NCBI網站下載南瓜、黃瓜及擬南芥的GH3蛋白序列與普通絲瓜GH3蛋白序列，進行合并系統進化分析。利用MEGA軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)對普通絲瓜、黃瓜、南瓜和擬南芥GH3家族蛋白構建系統進化樹。用在線工具iTOL對已構建的普通絲瓜、黃瓜、南瓜和擬南芥的GH3家族蛋白系統進化樹進行美化處理。

1.5 普通絲瓜長果品種、短果品種GH3基因家族成員的差異表達模式分析

根據筆者所在課題組前期研究得出的普通絲瓜長果品種、短果品種轉錄組數據中的基因表達值(FPKM)，分析普通絲瓜基因家族成員在普通絲瓜長果品種、短果品種中的表達情況，采用TBtools繪制表達量熱圖。

2 結果與分析

2.1 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白的鑒定及理化性質分析

通過對普通絲瓜基因家族成員進行篩選和鑒定，最終確定14個基因，暫將其命名為～。通過ProtParam在線分析軟件獲得普通絲瓜LcGH3蛋白氨基酸序列的蛋白序列長度、分子量、蛋白酸堿性和穩定性等基本信息。從表1可以看出，普通絲瓜LcGH3蛋白的蛋白序列長度為515～843 aa，分子量為58.366～96.406 ku；從等電點可以看出，LcGH3.8、LcGH3.14為堿性蛋白，其他普通絲瓜的LcGH3蛋白都為酸性蛋白；LcGH3.1的不穩定系數小于40，表明其是穩定蛋白，其他普通絲瓜LcGH3蛋白的不穩定系數均大于40，為不穩定蛋白。在蛋白質親水性方面，14個普通絲瓜LcGH3蛋白的平均親水系數均為負數，表明它們都是親水蛋白。

表1 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白的理化性質

2.2 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白的保守結構域分析

對普通絲瓜基因家族成員蛋白的保守結構域進行分析，發現14個基因家族成員蛋白均含有單一的GH3結構域，其中LcGH3.1、LcGH3.2和LcGH3.4等11個蛋白含有GH3超家族結構域(圖1)。為了進一步研究普通絲瓜基因家族成員蛋白的保守結構域，利用MEME在線分析軟件對普通絲瓜GH3蛋白保守基序進行分析。從圖2可以看出，普通絲瓜GH3蛋白的基序具有一定的保守性。14個普通絲瓜基因家族成員的蛋白質序列中至少含有10個保守基序，它們分別為Motif 1～Motif 10，并且這些保守基序的排列順序相同。其中，LcGH3.8蛋白缺少Motif 10、Motif 2，LcGH3.9蛋白缺少Motif 3，LcGH3.10蛋白缺少Motif 8，其他基因家族成員同時含有10個保守基序。此外，這14個普通絲瓜GH3蛋白家族成員中均含有Motif 1、Motif 4、Motif5、Motif6、Motif7和Motif 9。

2.3 普通絲瓜GH3基因家族蛋白的系統進化樹

用MEGA軟件構建普通絲瓜GH3家族蛋白(14個)、黃瓜GH3家族蛋白(14個)、南瓜GH3家族蛋白(29個)和擬南芥GH3家族蛋白(30個)的系統進化樹。根據系統進化樹的進化關系，這87個GH3蛋白可分為3類，分別是GroupⅠ、Group Ⅱ和Group Ⅲ(圖3)。其中，南瓜、絲瓜和黃瓜的GH3蛋白屬于Group Ⅱ或Group Ⅲ；在普通絲瓜中，LcGH3.3、LcGH3.7、LcGH3.13屬于Group Ⅱ，其他11個絲瓜GH3蛋白屬于Group Ⅲ；此外，在Group Ⅱ、Group Ⅲ中也有擬南芥的GH3蛋白。值得注意的是，GroupⅠ中都是擬南芥的GH3蛋白。

2.4 普通絲瓜長果品種、短果品種GH3基因家族成員的差異表達模式分析

基于普通絲瓜長果品種、短果品種商品果的轉錄組數據中14個基因家族成員的基因表達值(FPKM)，分析基因家族成員的表達模式，發現在普通絲瓜長果品種、短果品種商品果中共有6個基因家族成員(、、、、和)存在差異表達，其中、、在短果品種中的相對表達量高于長果品種，、、在短果品種中的相對表達量低于長果品種(圖4)。

3 討論與結論

植物的基因是一種典型的植物生長素原初反應基因，廣泛存在于植物中。GH3蛋白通過調節植物激素和相關化合物(包括植物激素前體)的活性或可利用性，在信號通路、器官發育、植物結構、增強植物的抗逆性、優化植物的生長和代謝過程中起著重要作用?；蜃钤缭诖蠖怪斜昏b定為早期的生長素響應基因。迄今，研究者陸續在許多來自不同植物(如擬南芥、水稻、葡萄、番茄、桃、木瓜、獼猴桃、甘藍等)的基因家族中發現該基因家族成員。

本研究結果表明，普通絲瓜中的14個LcGH3蛋白主要含10個Motif，且14個LcGH3蛋白均含有Motif 1、Motif 4、Motif5、Motif6、Motif7和Motif 9保守基序，推測這6個保守基序可能在普通絲瓜基因中發揮主要功能。構建基因家族系統發育樹來分析同源基因間的進化關系，可為后續基于同源同功假說的分析奠定基礎。本研究通過構建普通絲瓜、黃瓜、南瓜和擬南芥基因家族成員蛋白的系統發育樹，發現南瓜、絲瓜和黃瓜的GH3蛋白屬于Group Ⅱ或Group Ⅲ，而在GroupⅠ中都是擬南芥的GH3蛋白，后續關于絲瓜GH3的功能研究可以借鑒黃瓜、南瓜中已有的相關研究。本研究結果表明，在普通絲瓜長果品種、短果品種商品果中共有6個基因家族成員存在差異表達，推測基因家族與普通絲瓜果實發育相關，且與果長關系密切。對桃、番茄GH3蛋白的相關研究也發現，基因在果實不同發育時期的表達量均存在差異。在研究中，、、在短果品種中表達量高于長果品種，、和在短果品種中的表達量低于長果品種，將為后續研究絲瓜果長提供方向。

本研究基于普通絲瓜全基因組對基因家族進行鑒定，鑒定獲得14個基因家族成員，開展生物信息學分析并探析其在普通絲瓜長果品種、短果品種中的表達情況，為后續繼續深入研究基因在普通絲瓜果實發育及果長中的作用奠定了基礎，并可為培育滿足市場多樣化優良果長的絲瓜品種提供支撐。