5份大白菜葉卷曲突變體卷曲特性研究

張 楠， 趙姣姣， 崔維霞， 劉富強， 秦瑞鑫， 軒淑欣， 劉夢洋， 李 娜， 趙建軍， 孫曉雪， 盧 銀

(1.河北農業大學園藝學院/河北省蔬菜種質創新與利用重點實驗室/河北省蔬菜產業協同創新中心，河北保定 071000；2.保定市農業科學院，河北保定 071033)

葉片是植物進行光合作用，維持機體生長發育的主要器官。卷曲是葉片的一種特殊形態，受多基因互作、激素水平和外界環境因素的調控。葉片卷曲與作物生長發育密不可分，一方面葉片卷曲程度和類型的變化通過影響光合作用、蒸騰作用等重要生理生化反應，進而降低植物的生長發育及生物量的積累，導致多個葉片相關性狀發生改變；同時葉片卷曲也是植物響應、反饋并適應外界環境的自我保護行為。對于大白菜、結球甘藍等葉菜類蔬菜而言，葉片向內卷曲形成葉球是其典型的發育特征，葉球的形狀、抱合方式、緊實程度等重要農藝性狀均與葉片的卷曲形態、程度等息息相關，因此準確評價葉片卷曲、挖掘葉卷曲調控基因意義重大。

葉片卷曲屬于立體的三維形態變化，卷曲程度、卷曲發生部位、卷曲方向等變化多樣，僅通過肉眼觀察和語言描述很難進行準確全面的評價，因當前技術條件有限，三維立體成像技術無法在大規模田間表型性狀調查中廣泛應用，因此須建立一個適于大規模開展、較目測更為準確的卷曲評價方法。水稻葉片卷曲評價的研究較多，水稻卷葉突變體、()、、、以及雜交水稻均以卷曲指數(LRI)評價葉片卷曲的程度。該指數也被成功地應用于花生和玉米的葉片卷曲的評價中。袁玉菊等則采用縱卷指數(LC)和側卷指數(TC)分別評價擬南芥、甘藍和結球甘藍的葉片卷曲。Liu等用曲率指數(CI)評價擬南芥突變體的葉片彎曲。李平霞進一步將CI拓展為葉片橫向卷曲度(CIT)和葉片縱向卷曲度(CIL)來評價白菜葉片的卷曲。總結分析發現，雖然這些卷曲指數的名稱不同，但測量和計算方法具有一致性，因此該指數能夠在一定程度上實現卷曲的快速、準確的評價。

影響葉片卷曲的因素眾多，在能夠準確評價葉片卷曲的基礎上，探究卷曲形成因素首先應進行表型性狀的調查分析，即明確葉片卷曲特點，觀察分析葉片其他表型變化及二者之間的關系。如在以往葉卷曲的相關研究中普遍發現，葉卷曲突變體多伴有植株矮小、發育遲緩等不良表型。在眾多表型中，葉片形狀作為葉片最基本的形態特征與葉片卷曲是否存在必然的聯系，在以往的報道中，因研究材料較少規律性不明顯、遺傳背景不一致等因素相關報道較少，因此有待進一步深入研究。

細胞是植物結構和功能的基本單位，葉片細胞結構主要包括上下表皮、柵欄組織和海綿組織等，這些細胞的狀態和行為之間的相互作用最終決定了葉片的形態，因此觀察葉片細胞結構變化也是葉片卷曲研究的重要方法。在玉米和水稻等禾本科植物葉片卷曲材料的細胞學變化研究中，發現泡狀細胞大小和數量的變化是導致葉片發生卷曲的關鍵因素。在其他無泡狀細胞的作物中，多認為細胞形態、極性、細胞的不均勻生長等是引起葉片卷曲的重要因素。Nath等在對金魚草葉片邊緣褶皺突變體的研究中，推測葉片中心區域的葉肉細胞分裂速度慢于葉邊緣區域是葉片發生褶皺的原因。Nelson 等認為引起玉米突變體葉片向上卷曲的原因是葉片表皮細胞近遠軸細胞發生了極性顛倒。史靈敏認為柵欄組織細胞間隙增大，貯水組織排列疏松是花生卷葉突變體發生葉片卷曲的直接原因。余琳認為葉片柵欄組織和海綿組織細胞形態一致，未正常分化，是擬南芥葉片內卷突變體與野生型具有不同葉片卷曲表型的原因。劉慧珊對比分析大白菜野生型和葉片內卷突變體的葉肉細胞，認為細胞分布不均勻，柵欄組織與海綿組織細胞較小且排列不規則是導致葉片發生內卷的原因。由于這些結果源于不同物種，且只是針對1份或幾份材料的研究分析，因此未發現明確的規律性。

本研究以相同遺傳背景下的大白菜野生型A03和5份不同葉卷曲突變體為試驗材料，通過表型性狀調查、卷曲指數測定、卷曲部位的葉片細胞結構觀察，探討突變體的其他變異表型、卷曲指數、葉片細胞結構變化、葉形指數及葉片不同部位葉長變化與葉片卷曲表型的關系，以期為葉片卷曲評價體系的建立、葉形和葉片細胞結構與卷曲表型的相關性研究提供思路，為卷曲調控基因的深入挖掘及互作研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以大白菜野生型A03和甲基磺酸乙酯(EMS)誘變獲得5份不同葉卷曲突變體S59、S300、S313、S339、SL6為試驗材料。于2020年8月8日在河北農業大學教學試驗基地溫室內進行播種和標準化育苗，9月3日定植于露地，緩苗后開始進行調查，每份材料成活30株以上，各株生長條件一致，四周設保護行，進行常規田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片相關表型性狀的調查 表型性狀調查參考GB/T 19557.5—2017《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 大白菜》(即大白菜DUS測試)，以苗期真葉、蓮座期蓮座葉和結球期最大球葉(不結球突變體選取相同葉位的葉片)為調查對象，通過觀察和測量調查葉片相關的21個表型性狀，其中可觀測性狀13個，分別為各時期葉片的卷曲情況，蓮座期葉色、葉緣鋸齒、葉緣褶皺、葉緣波狀、茸毛，結球期株型、結球情況、球頂部包合狀態，收獲期中肋顏色、葉球顏色、球內葉顏色、中心柱形狀。可測量性狀共8個，分別為各時期的葉形指數(leaf shape index，簡稱LSI)，結球期株高、株展、外葉數，收獲期葉球高、葉球寬、葉球質量及植株鮮質量，具體調查方法見表1。以葉片為測定對象的性狀，測定3株，每株選取相同葉位3張葉片，共9個生物學重復，其他性狀3個生物學重復。

表1 表型性狀調查方法、分類標準及調查時期

1.2.2 卷曲指數測定 選取相同的葉片測定LSI，每份材料9個生物學重復，分別測量自然狀態和壓平狀態下的葉長、葉寬，計算側卷曲指數(CIW)和CIL，葉片向內(近軸側)卷曲則卷曲指數為正值，葉片向外(遠軸側)卷曲時卷曲指數為負值，具體測定方法見表2和圖1-A、圖1-B。

表2 卷曲指數測量和計算方法

1.2.3 葉片卷曲部位的細胞觀察 以LSI測定相同葉位葉片，3株生物學重復，選取具有明顯卷曲表型且位置相同的部位[葉片兩側靠近葉緣1～2 cm處(圖1-C)]制作石蠟切片。觀察細胞結構并利用image軟件統計葉片表皮細胞、柵欄組織和海綿組織的細胞層數、細胞厚度、細胞大小(以隨機選取的10個細胞切面面積的平均值作為細胞大小)。計算海綿組織與柵欄組織厚度比(spongy tissue and palisade tissue cell thickness ratio，簡稱SPTR)=海綿組織厚度/柵欄組織厚度；葉片細胞厚度比(cellthickness ratio，簡稱CTR)=(海綿組織厚度+下表皮厚度)/(柵欄組織厚度+上表皮厚度)，分別計算蓮座期和苗期的CTR、SPTR及側卷指數(CIW)的比值()，并進行相關性分析。=/；=/；=/。

1.2.4 葉長葉寬變化與卷曲指數的相關性分析 選取未卷曲的新生葉片，將葉片最長和最寬位置分別記為L和W，將葉長和葉寬平均劃分7等份，左側和上側記為L～L、W～W；右側和下側記為L～L、W～W(圖1-E、圖1-F)。以10 d為1個周期，分別于2020年10月5日至11月4日連續4次測定同一葉片不同部位的葉長、葉寬，并計算LSI、CIW、CIL和葉片中間較兩側葉長的差異Δ，ΔL-(L+L)/2，3個生物學重復。考慮葉形及葉片長度本身的差異，以第1次葉片未發生卷曲時的LSI、CIW及Δ為基礎，分別計算第次較第1次測量LSI、CIW和Δ的變化，并進行相關性分析。Δ=(-LSI)/LSI；Δ=-；Δ-1=(Δ-Δ)/Δ。

1.3 統計分析

使用Excel和SPSS軟件對上述表型和細胞學數據進行標準差計算、顯著性分析及相關系數的計算。

加快農業發展、增加農民收入是農業、農村工作面臨的首要問題和中心任務，也是農業、農村工作的出發點和落腳點。鑒于林芝市深入貫徹落實西藏自治區第九次黨代會和西藏自治區農村工作會議精神，特別是西藏自治區領導的重要講話精神和指示要求，筆者結合林芝市青稞生產實際就如何提高青稞產量提出自己的淺見。

2 結果與分析

2.1 葉片表型性狀調查與變異分析

通過對3個時期的葉片卷曲表型觀察發現，野生型A03在3個時期均表現為兩側稍內卷。突變體S59、S300、SL6在3個時期也表現為葉片兩側內卷且內卷程度大于A03，S339苗期呈現葉緣內卷，后期兩側內卷程度大于A03；S313苗期和蓮座期表現為兩側稍內卷，結球期葉緣外翻(圖2)。3個時期6份材料葉片兩側均有卷曲變化，通過觀察發現苗期和蓮座期葉片兩側向內卷曲程度表現為SL6>S59≈S339>S300>S313≈A03；結球期表現為 SL6>S59 ≈A03>S300≈S339>S313(外翻)。

計算LSI并參考國標中的分類標準，A03各時期的LSI介于1.3～1.7之間，葉形為倒卵形。SL6各時期的LSI介于1.83～1.86之間，且顯著大于A03的LSI，葉形為長倒卵形。S313早期的LSI與A03的LSI無顯著差異，僅結球期的LSI為1.90，且顯著高于A03的LSI，因此早期為倒卵形，結球期變為長倒卵形(表3)。

表3 大白菜不同時期的葉形指數

在13個可觀察表型性狀中，野生型A03主要表現為葉緣大波，結球、包合方式為舒心。5份突變體僅在葉緣波狀和結球性2個性狀上發現表型突變，不結球突變材料共有4份，分別為S59、S300、S313、S339，其中S313雖然并未抱合成球但成熟期中部葉片排列緊湊，此外，S300出現葉緣中波變異(表4)。

在8個可測量性狀中，5份突變體變異性狀在 3～11個不等，其中S59、S300、S339、SL6等4份材料的株高、株展、 鮮質量均顯著小于A03， 結球突變體SL6所有4個葉球相關的性狀均顯著小于A03(表4、表5)。

表4 表型性狀調查與分析

表5 5份大白菜葉卷曲突變體的表型變異統計分析結果

2.2 以CI評價葉卷曲情況

分析6份材料3個時期的CIW和CIL，結果(圖3)表明，野生型A03的CIL在3個時期均為0，突變體中2份材料的CIL具有數值，其中S313結球期的CIL為 -0.04，極顯著小于A03，S339苗期的CIL為0.02，顯著大于A03。CIW表現多樣，A03在3個時期的CIW分別為0.13、0.25、0.31，呈現逐漸增加的趨勢。突變體中S313結球期的CIW為-0.30，苗期、蓮座期與野生型A03無顯著差異；S59、S300、S339、SL6在苗期和蓮座期的CIW均極顯著大于A03，結球期僅SL6仍極顯著大于A03，其余3份與A03無顯著性差異。 根據不同時期的CIW由大到小排序，苗期和蓮座期表現為SL6>S59>S339>S300>S313>A03，結球期表現為SL6>S59>A03>S300>S339>S313，與目測結果一致且兩側向內卷曲程度與CIW呈正相關。

2.3 大白菜突變體葉片卷曲部位細胞結構分析及相關性分析

2.3.1 葉片卷曲部位的細胞結構變異分析 比較分析A03和5份突變體卷曲部位葉片細胞的層數，結果表明，在細胞層數上，6份材料苗期和蓮座期上下表皮細胞均為1層。S59、S313柵欄組織和海綿組織細胞層數與A03均無顯著差異，且苗期和蓮座期細胞層數基本一致。苗期S300、S339和SL6海綿組織的細胞層數均顯著小于A03，蓮座期3份突變體的細胞層數與A03均無顯著差異(圖4-A，表6)。

表6 不同時期細胞層數統計分析結果

比較分析葉片卷曲部位不同類型細胞厚度的差異，結果表明，6份材料的上下表皮細胞厚度差異不明顯，僅2份突變體具有顯著性差異，其中S59僅在蓮座期柵欄組織的細胞厚度極顯著大于A03；S339海綿組織的細胞厚度在苗期和蓮座期均顯著大于A03，柵欄組織的細胞厚度僅在蓮座期極顯著大于A03(圖4-B，表7)。

表7 不同時期細胞厚度統計分析結果

表8 不同時期細胞大小統計分析結果

2.3.2 細胞結構變化與卷曲的相關性分析 通過分析葉肉細胞相關數據發現，5份突變體較野生型A03未發生不同細胞排列、結構或類型的明顯變異，表皮細胞的層數、厚度及大小變化也不明顯，而柵欄組織和海綿組織細胞厚度、大小及細胞生長速度變化明顯，細胞層數也發生不同程度的變化，經研究發現細胞大小及層數變化與卷曲形態無明顯相關性，而不同細胞或不同部位細胞的厚度比與卷曲表型存在一定聯系，其關系表現為與的變化規律一致，計算相關系數為0.91，因此二者相關性較強。此外與的變化規律也具有一致性，相關系數為0.84，因此也具有一定相關性(圖5，表9)。

表9 細胞厚度比、柵欄組織與海綿組織厚度比與卷曲變化的相關性分析結果

2.4 葉長葉寬變化與卷曲的相關性分析

2.4.1 葉片不同部位生長情況的變異分析 分析同一葉片4次測定的LSI數據，結果表明，除S313第4次測量葉形指數高達2.04外，S313前3次測定以及其余5份材料4次測定的LSI均介于1.31～1.65之間(表10)。

分析連續4次測量的L～L和W～W數據發現，6份材料不同部位長寬數值均呈現逐漸增加的趨勢，L的葉長較兩側生長迅速，L～L生長趨勢呈倒“V”形趨勢，而葉寬W～W生長趨勢呈較均勻的拋物線狀，葉長長勢與葉寬長勢不同，因此葉形發生變化(圖6)。比較4次測定3個周期的葉長和葉寬生長情況發現，6份材料均表現為第2周期生長最快，第3周期生長最慢，僅S313在第3周期仍保持較快的生長速度，可能與其卷曲形態的特定表達時期有關，即該時期S313開始出現葉片外翻表型。

2.4.2 葉形指數與卷曲指數的相關性分析 分析6份材料葉形指數(LSI)與CI的關系，計算表型調查數據中苗期、蓮座期和結球期LSI與CIW的相關系數分別為0.62、0.29、-0.36，苗期和結球期LSI與CIL的相關系數分別為-0.17、-0.69(蓮座期CIL均為0，無法分析)，相關性較弱(表10)。不同材料、不同葉位的葉片大小和形狀差異的影響，計算同一葉片連續4次測定的LSI～LSI與CIW～CIW的相關系數分別為-0.35、-0.11、-0.03，相關性較弱(表10)。

表10 葉形指數與卷曲指數的相關性分析結果

以第1次未發生卷曲的LSI和CI為基礎，進一步分析ΔLSI與ΔCIW的相關系數，分別為-0.28、-0.13、0.08，因此相關性也不大(表11)。除第4次測定S313的CIL有數值外，6份材料4次測定的CIL均為0，而LSI的大小變化各異，因此LSI與CIL無明顯相關性。綜上所述，未發現LSI與CI存在明顯相關性。

表11 ΔLSI與ΔCIW的相關性分析結果

2.4.3 葉片不同位置葉長變化與側卷指數的相關性分析 前期觀察發現，葉片卷曲往往伴有葉片形狀尤其是葉長的變化，本研究結果證實LSI與CI相關性不大，進一步分析葉片不同部位葉長變化與側卷表型變化的關系，計算4次測定的3個Δ與Δ的相關系數，分別高達0.91、0.97、0.98(圖7，表12)，因此可知L較兩側的葉長差變化與葉片側卷程度變化相關性極強。

表12 葉形與側卷指數的相關性分析結果

3 討論與結論

表型性狀調查結果表明，5份葉卷曲突變體變異表型數量為3～11個不等，分析發現在突變性狀中除S300存在葉緣中波變異外，其他性狀如不結球、株高、株展、鮮質量等與葉卷曲相關，推測葉片發生卷曲后有效光合面積降低，使突變體有機物積累能力變弱，生物量積累減少，從而伴有植株生長緩慢、矮小、葉片變小等性狀。這與前人的研究結果相同，如陳亞同發現水稻葉卷曲突變體株高、鮮質量明顯小于野生型；劉慧珊發現白菜葉卷曲突變體伴有植株矮小性狀，葉長、葉寬顯著小于野生型。此外，本研究試材為EMS誘變2次所得，多次誘變也是產生多表型變異的重要原因，在同一突變體庫的其他研究中也有相似結果。

本研究以觀察和卷曲指數2種方法評價野生型A03和5份突變體的卷曲形態，結果證實卷曲指數較目測可以在一定程度上更準確地評價葉片卷曲程度。余琳等在擬南芥、大白菜、水稻葉片的卷曲研究中均獲得了相同的結論。然而該指數并不完善，本研究中6份材料因卷曲形態比較簡單，CI規律可以比較，如遇到葉片兩側卷曲方向不一致(擰卷)或卷曲部位不規則等情況較難準確評價。此外由于測量計算相對較為耗時耗力，因此在大規模材料的田間調查中更先進、準確、便捷的葉片卷曲評價技術手段有待進一步開發。

在葉形、葉片細胞結構變化與葉片卷曲表型變化的相關研究中，受限于遺傳背景差異或研究材料的數量，以往學者僅能獲得1～2份葉卷曲材料的葉片形狀、葉片細胞結構或比較2～3份材料間的差異，雖發現葉片卷曲多伴有葉形的變化，明確葉卷曲必然由葉片細胞變化相關，但如何相關卻無人探討。本研究中6份材料的遺傳背景一致，環境條件一致，葉片兩側均具有內卷表型且CIW表現各不相同，石蠟切片取材的葉片部位基本一致且均為卷曲發生部位，因此是研究葉形及葉片細胞結構變化與卷曲表型變化規律的良好材料。本研究也分別獲得了階段性的創新研究結果，為卷曲的深入研究奠定了基礎。但本研究中僅分析了側卷部位一個位置的細胞變化，雖然不同細胞厚度變化與卷曲表型具有較強的相關性，但無法判斷是否為直接引起葉片卷曲表型變化的原因，需要進一步對比分析卷曲部位和未卷曲部位的細胞結構差異，以探討引起突變體不同葉片卷曲表型的具體細胞結構變化成因。此外，本研究結果源于遺傳背景相同的6份大白菜，在不同作物、不同背景或數量規模較大的群體中是否成立有待進一步研究。