阿魏酸通過Sirt1/NLRP3通路抑制電離輻射引起的人小腸上皮細胞炎癥

張雪梅，胡昌坤，劉桂芳，謝光輝，梅 雨，張慧婷，高 月，馬增春

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850；3.安徽醫科大學基礎醫學院，安徽 合肥 230032）

放射性腸炎是腹盆腔腫瘤放療后最常見的并發癥，主要癥狀為電解質失衡、腹痛、腹瀉和脫水等，嚴重者可出現腸梗阻、腸穿孔甚至死亡［1］。小腸是人體內對電離輻射最敏感的器官之一，由于腸上皮分裂快速，在受到高劑量電離輻射時會產生急性損傷［2］，導致腸通透性增加和腸黏膜屏障功能障礙，誘發多種腸道疾病。研究表明，電離輻射產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）等自由基能夠抑制小腸黏膜再生，導致放射性腸炎。當腸黏膜屏障受到破壞時，腸道可向血循環中釋放促炎因子和其他炎癥介質，嚴重者腸道內細菌從腸腔轉移至血循環中，并釋放內毒素，引起全身性炎癥反應［3］。因此，保護腸道免受輻射引起的炎癥損傷至關重要。目前對于放射性腸炎，除對癥治療外尚無有效的治療藥物，因此迫切需要開發有效的防治新藥。

沉默信息調節因子1（silence information regulator 1，Sirt1）是一類腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性去乙酰化酶，能使多種組蛋白和非組蛋白底物去乙酰化，從而調節氧化應激、炎癥、衰老和凋亡等細胞過程［4］。Sirt1的激活可改善全身照射誘導的骨髓損傷、間充質干細胞炎癥和卵巢炎癥［5-7］。在輻射誘導的腸道損傷中，激活Sirt1也有一定的保護作用［1］。因此，Sirt1可能是治療放射性腸炎的關鍵因子。Nod樣受體家族蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎癥小體是一種多蛋白復合物，識別特定的信號后通過凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis associated specklike protein containing a CARD）招募胱天蛋白酶1，促進下游促炎因子白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）合成和釋放，進而引發一系列炎癥反應［8］。Sirt1可通過對炎癥轉錄因子去乙酰化作用抑制NLRP3炎癥小體的表達而發揮抗炎作用［9］。近年來研究發現，NLRP3炎癥小體表達上調在輻射損傷中起著關鍵作用［10］，如NLRP3炎癥小體激活參與輻射誘導的腸道損傷［11］。因此，Sirt1/NLRP3通路可能是防治放射性腸炎的重要靶點。

阿魏酸是植物界普遍存在的一種酚類植物成分。本課題組前期研究表明，阿魏酸作為具有抗輻射作用的中藥方劑四物湯中的一個有效成分，在輻射引起的氧化、炎癥和凋亡等方面起到很好的抗輻射作用［9，12］。阿魏酸可通過抑制 NLRP3 炎癥小體減輕輻射誘導的AHH-1細胞和小膠質細胞炎癥［13-14］，也可通過增加小腸絨毛細胞核中高遷移率族蛋白B1而抑制炎癥反應，從而發揮對放射性腸損傷的保護作用［15］。據報道，阿魏酸可通過激活Sirt1減輕輻射引起的炎癥反應［16］。因此，本研究以Sirt1/NLRP3通路為切入點，進一步探索阿魏酸防治放射性腸損傷的作用機制，為治療放射性腸損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞、試劑和儀器

阿魏酸，純度≥99.0%，美國Sigma-Aldrich公司，精密稱取阿魏酸粉末970.95 μg，加入二甲亞砜1 mL，配制濃度為5 mmol·L-1的母液，分裝避光保存于-20℃備用；使用時用含2%胎牛血清的RPMI 1640培養基稀釋至所需濃度；據預實驗結果，確定阿魏酸給藥濃度為0.01，0.10和1.00 μmol·L-1。人小腸上皮細胞HIEC6，深圳市豪地華拓生物科技有限公司，以含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基于37℃，5%CO2的細胞培養箱中培養。RPMI 1640培養基，美國Gibco公司；特級胎牛血清，Lonsera烏拉圭（南美）公司；二甲亞砜，北京InnoChem科技有限公司；人IL-1β ELISA試劑盒，江蘇酶免實業有限公司；兔抗人NLRP3抗體和CoraLite594標記山羊抗兔IgG抗體，美國Proteintech公司；兔抗人Sirt1抗體，美國Abcam公司；兔抗人胱天蛋白酶1和IL-1β抗體，成都正能生物技術有限責任公司；兔抗人活化胱天蛋白酶1抗體，美國Signalway Antibody公司；免疫染色固定液、洗滌液、封閉液、抗體稀釋液和抗熒光淬滅封片劑（含DAPI），上海碧云天生物技術有限公司；PCR試劑盒，北京全式金生物。MCO-20AIC型恒溫細胞培養箱，日本SANYO公司；ME204型精密分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FACS Calibur型流式細胞儀，美國Bacton Dickinson公司。VICTORTM X5型多標記酶標儀，美國Perkin Elmer公司；JY96-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；ImageQuant LAS 500型顯影儀，美國General Electric公司；電泳儀、電泳槽和轉膜儀，美國Bio-Rad公司；活細胞成像微孔板檢測儀，美國Bio-Tek公司；60Co γ射線輻照裝置由軍事醫學研究院輻射醫學研究所提供，單次照射劑量率為64.46 cGy·min-1。

1.2 CCK-8法檢測HlEC6細胞存活率

取對數生長期HIEC6細胞接種于96孔板中，每孔8×103細胞。細胞接種24 h后分別經60Co γ射線4，6，8，10和14 Gy照射。每組設4復孔。照射后繼續培養24 h，按CCK-8試劑盒說明書操作，隨后于全波長酶標儀測定各孔450 nm吸光度（A450nm）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（照射組A450nm-空白對照組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白對照組A450nm）×100%。

1.3 DCFH-DA探針法測定HlEC6細胞內ROS水平

取對數生長期HIEC6細胞接種于100 mm大皿中，培養24 h后分別以60Co γ射線4，6，8，10和14 Gy照射，每組設3復孔。照射后24 h收集細胞，將細胞懸浮于已稀釋的DCFH-DA中，37℃孵育20 min。用RPMI 1640培養基洗滌細胞3次，以充分除去未進入細胞內的DCFH-DA。細胞裝載探針后用流式細胞儀檢測平均熒光強度（每組檢測1×104細胞，計算每細胞內平均熒光強度），表示細胞內ROS水平。

1.4 ELlSA檢測HlEC6細胞上清中lL-1 β含量

取對數生長期HIEC6細胞接種于100 mm大皿中，設細胞對照組、照射組、照射+阿魏酸0.01，0.10和1.00 μmol·L-1組。各組培養12 h后，照射+阿魏酸組加入阿魏酸；繼續培養12 h后，照射組和照射+阿魏酸組以60Co γ射線10 Gy單次照射。照射后24 h收集細胞上清，用ELISA試劑盒檢測IL-1β含量。

1.5 免疫熒光法檢測HlEC6細胞NLRP3蛋白表達水平

取對數生長期HIEC6細胞接種于20 mm激光共聚焦小皿中，細胞分組和處理同1.4。照射后24 h用PBS清洗細胞2次，每次10 min。用封閉液室溫封閉30 min，洗滌3次，室溫固定2 h后加入兔抗人NLRP3抗體（1∶500）4℃冰箱孵育過夜。洗滌3次，每次10 min；加入CoraLite594標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶500）室溫孵育1 h。洗滌3次，每次10 min。用活細胞成像微孔板檢測儀檢測細胞內NLRP3熒光強度。所觀察區域熒光強度總和與區域面積的比值，表示NLRP3蛋白表達水平。

1.6 實時定量PCR檢測Sirt1、NLRP3、胱天蛋白酶1和IL-1β mRNA表達水平

取對數生長期HIEC6細胞接種于100 mm大皿中，細胞分組和處理同1.4。照射后24 h采用Trizol法提取HIEC6細胞總RNA。據逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，用實時定量PCR檢測Sirt1、NLRP3、胱天蛋白酶1和IL-1 βmRNA表達水平。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應條件為：94℃變性30 s，隨后94℃退火30 s和60℃延伸30 s共40～50次循環。所有目的基因mRNA定量結果均通過熔解曲線分析驗證PCR產物的特異性，確保產物無引物二聚體，每樣本重復3次。用2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達水平。

Tab.1 Sequences of primers for real time-quantitative PCR(RT-qPCR)

1.7 Western印跡法檢測Sirt1、NLRP3、胱天蛋白酶1、活化胱天蛋白酶1和lL-1 β蛋白表達水平

取對數生長期HIEC6細胞接種于100 mm大皿中，細胞分組和處理同1.4。照射后24 h提取細胞總蛋白，按照BCA試劑盒說明書進行蛋白定量后，每個樣孔加入30 μg蛋白樣品，以10%SDSPAGE進行電泳，濕法轉PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉3 h，一抗〔抗Sirt1（1∶1000）、NLRP3（1∶1000）、胱天蛋白酶1（1∶1000）、活化胱天蛋白酶1（1∶1000）和IL-1β（1∶1000）〕4℃孵育過夜，洗膜后加入CoraLite594標記山羊抗兔IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h，再次洗膜后用ECL化學發光法顯影。以β肌動蛋白作為內參，采用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值進行分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IAβ肌動蛋白表示。

1.8 統計學分析

實驗結果數據用±s表示，采用SPSS 25.0軟件進行統計分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，用單因素方差分析（one-way ANOVA）分析數據，組間比較方差齊用LSD檢驗，方差不齊采用DunnettT3檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 60Co γ射線對HlEC6細胞存活率的影響

與細胞對照組比較，60Co γ射線4，6，8，10和14 Gy照射后24 h，細胞存活率均顯著下降（P＜0.01）（圖1），提示60Co γ射線可導致HIEC6損傷。

Fig.1 Changes of cell viability of human intestinal epithelia cells HlEC6 24 h after60Co γ ray irradiation.HIEC6 cells were irradiated with60Co γ rays at 4，6，8，10 and 14 Gy，and then cultured for 24 h.Cell viability was detected by CCK-8 kit.Cell viability（%）=（A450 nmof radiation group-A450 nmof blank group）/（A450nmof cell control group-A450 nmof blank group）×100%.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.2 60Co γ射線對HlEC6細胞內ROS水平的影響

圖2結果顯示，與細胞對照組相比，60Co γ射線4，6，8，10和 14 Gy照射后 24 h，HIEC6細胞內ROS水平均顯著升高（P＜0.01），其中10 Gy組最為明顯，表明γ射線可導致HIEC6細胞氧化損傷，HIEC6細胞對10 Gy輻射劑量較為敏感。因此后續實驗照射劑量選為10 Gy。

Fig.2 Changes of reactive oxygen species（ROS）level in HlEC6 cells 24 h after60Co γ ray irradiation.See Fig.1 for the cell treatment.The intracellular ROS level was detected by DCFH-DA probe method and expressed by the mean fluorescence intensity（FI）of 1×104cells per group.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 阿魏酸對照射后HlEC6細胞上清中lL-1 β含量的影響

圖3結果顯示，與細胞對照組相比，照射組HIEC6細胞上清中IL-1β含量顯著升高（P＜0.01）；與照射組相比，照射前12 h預先給予阿魏酸0.10 μmol·L-1可使細胞上清中IL-1β含量顯著降低（P＜0.01），0.01和1.00 μmol·L-1作用不明顯，提示阿魏酸0.10 μmol·L-1可降低γ射線引起的HIEC6細胞炎癥反應。

Fig.3 Effect of ferulic acid（FA）on level of lL-1 β in supernatant of HlEC6 cells 24 h after60Co γ ray irradiation determined by ELlSA.The cells of irradiation+FA 0.01，0.10 and 1.00 μmol·L-1groups were pretreated with FA for 12 h before a single irradiation of60Co γ ray with 10 Gy was performed.24 h after irradiation IL-1β level was determined.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with irradiation group.

2.4 阿魏酸對照射后HlEC6細胞NLRP3蛋白表達水平的影響

圖4結果顯示，與細胞對照組相比，照射組紅色熒光強度顯著增強（P＜0.05）；與照射組相比，照射前12 h預先給予阿魏酸0.01，0.10和1.00 μmol·L-1，紅色熒光強度減弱（P＜0.01），其中0.10和1.00 μmol·L-1作用更為明顯。由此表明，照射后HIEC6細胞NLRP3蛋白表達升高，預先給予阿魏酸可逆轉照射導致的NLRP3蛋白表達升高。

Fig.4 Effect of FA on NLRP3 protein expression level in HlEC6 cells 24 h after60Co γ ray irradiation（live cell imaging）.See Fig.3 for the cell treatment.The NLRP3 protein expression level was expressed as the ratio of the sum of FI and the area of the field of vision.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with irradiation group.

2.5 阿魏酸對照射后HlEC6細胞Sirt1/NLRP3通路相關基因mRNA表達的影響

圖5結果顯示，與細胞對照組相比，照射組Sirt1mRNA水平顯著降低（P＜0.05），NLRP3、胱天蛋白酶1和IL-1βmRNA水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。照射前12 h預先給予阿魏酸0.01，0.10和1.00 μmol·L-1，與照射組相比，Sirt1mRNA水平升高（P＜0.05，P＜0.01），NLRP3、胱天蛋白酶1和IL-1βmRNA水平被明顯抑制（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of FA on mRNA expressions of genes related to Sirt1/NLRP3 pathway in HlEC6 cells 24 h after60Co γ ray irradiation detected by RT-qPCR.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with irradiation group.

2.6 阿魏酸對照射后HlEC6細胞Sirt1/NLRP3通路相關蛋白表達的影響

圖6結果顯示，與細胞對照組相比，照射組Sirt1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），NLRP3、胱天蛋白酶1、活化胱天蛋酶1和IL-1β蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與照射組相比，照射前12 h預先給予阿魏酸0.01，0.10和1.00 μmol·L-1，Sirt1蛋白表達明顯升高（P＜0.01），NLRP3、活化胱天蛋白酶1和IL-1β蛋白表達被明顯抑制（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of FA on expressions of proteins related to Sirt1/NLRP3 pathway in HlEC6 cells after60Co γ ray irradiation detected by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B1 and B2 were the semi-quantitative results of A.IA：integrated absorbance.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with irradiation group.

3 討論

電離輻射引起的細胞損傷常表現為細胞增殖受抑制，產生過多的ROS自由基從而激活相關的信號通路。腸上皮細胞是機體抵御外界刺激侵入黏膜下層的第一道屏障，對維持腸道健康具有重要作用。為此，本研究室選擇人小腸上皮細胞HIEC6進行了預實驗，用CCK-8法檢測60Co γ射線4，6，8，10和14 Gy照射后12，24，36和48 h細胞存活率。結果表明，照射后24 h HIEC60細胞存活率隨照射劑量的增加平穩下降。因此，本研究選用HIEC6細胞并選用照射后24 h為檢測時間點為進行實驗。

電離輻射能夠刺激細胞產生過多的ROS，ROS作為調節炎癥信號通路的次級信使可引發一系列炎癥反應。本研究通過檢測60Co γ射線4，6，8，10和14 Gy照射后細胞存活率和細胞內ROS水平，發現細胞存活率均明顯降低，10 Gy照射劑量下ROS水平升高更為明顯。因此，后續實驗選擇10 Gy為照射劑量。

本研究結果表明，照射前12 h預先給予阿魏酸0.01，0.10 和 1.00 μmol·L-1，其中 0.10 μmol·L-1可顯著降低照射導致的IL-1β分泌增多，提示阿魏酸可有效改善照射誘導的HIEC6細胞炎癥反應。

ROS被認為是NLRP3炎癥小體激活調控的中心，輻射導致體內產生過多的ROS可通過激活NLRP3蛋白復合體誘導炎癥發生［17］。為驗證阿魏酸是否通過抑制NLRP3炎癥小體改善輻射導致的HIEC6細胞炎癥反應，本研究用免疫熒光實驗檢測HIEC6細胞內NLRP3蛋白表達。結果表明，照射后HIEC6細胞中NLRP3蛋白表達顯著增強，預先給予阿魏酸可抑制其表達，表明NLRP3炎癥小體參與輻射引起的HIEC6細胞炎癥反應，阿魏酸改善輻射導致的HIEC6細胞炎癥反應可能與抑制NLRP3表達有關。

Sirt1在調節炎癥反應中起到重要的作用，在體外實驗中沉默Sirt1基因可引起腫瘤壞死因子α，IL-1β和IL-6等炎癥因子水平升高，也可通過去乙酰化加工進而抑制NLRP3表達，發揮抗炎作用［18］。為此，本研究用實時定量qPCR和Western印跡實驗進一步驗證阿魏酸是否是通過激活Sirt1抑制NLRP3炎癥小體，從而減輕輻射誘導的HIEC6細胞炎癥反應。結果表明，照射后HIEC6細胞Sirt1 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，NLRP3、活化胱天蛋白酶1和IL-1β mRNA和蛋白表達水平均顯著升高；預先給予阿魏酸，Sirt1 mRNA水平和蛋白表達水平均顯著升高，NLRP3、活化胱天蛋白酶1和IL-1β mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。由此進一步提示，阿魏酸可能是通過激活Sirt1抑制NLRP3炎癥小體的活化而改善輻射引起的HIEC6細胞炎癥反應。

綜上，阿魏酸可通過激活Sirt1、抑制NLRP3炎癥小體活化而抑制活化胱天蛋白酶1和IL-1β表達，從而抑制輻射誘導的小腸上皮細胞HIEC6炎癥反應。本研究為治療放射性腸損傷提供了新靶點。