影響斑馬魚幼魚心臟發(fā)育和運動行為的囊胚期暴露二甲亞砜濃度探討

山 花，賀亞南，馮元州，何嘉玲，朝 寶，劉彩萍，王永安，董 武，張東威，趙寶全

（1.內(nèi)蒙古民族大學臨床醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；3.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所，北京 100081）

近年來，模式生物斑馬魚（zebra fish）因其胚胎和幼魚透明、與人類基因高度保守及適合高通量毒物藥物篩選等優(yōu)勢，在發(fā)育生物學、毒理學和藥理學研究中得到了廣泛應用［1-6］。在進行毒理學和藥理學實驗時，經(jīng)常遇到有些化合物溶解度較低或不溶解，需用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為助溶劑。DMSO是一種常用的既溶于水又溶于有機溶劑的極為重要的非質(zhì)子極性溶劑，對機體具有很強的滲透能力，又因其本身具有消炎止痛、利尿和鎮(zhèn)靜等作用，在醫(yī)藥工業(yè)中可直接用作某些藥物的原料及載體［7-9］。1961年，DMSO首次作為藥物制劑用做器官保護劑，后來發(fā)現(xiàn)DMSO對多種哺乳動物的晶狀體產(chǎn)生影響而被停止使用，自那時起DMSO便被認為是有毒物質(zhì)。作為助溶劑配制試劑，不同濃度DMSO對模式生物的影響不同，DMSO本身對生物體具有毒性作用，若使用不當，可能會造成假陽性實驗結(jié)果。斑馬魚對某些藥物非常敏感，現(xiàn)有相關斑馬魚胚胎發(fā)育的致死、孵化及畸形效應的研究表明，DMSO濃度≥0.6%時，斑馬魚胚胎在受精后48，72和96 h孵化率顯著下降，死亡率增加并產(chǎn)生大量畸形［10］。DMSO對心血管和神經(jīng)系統(tǒng)也具有一定的毒性作用，脊椎動物心臟的正常發(fā)育和功能對胚胎和出生后個體的行為活動至關重要。人類的許多先天性心臟缺陷均與心房靜脈和心肌起搏細胞形成或維持的基因斷裂有關［11］。肌球蛋白是一種高度保守、普遍存在于所有真核細胞中的蛋白質(zhì)，它為細胞分裂、吞噬和肌肉收縮等多種運動提供運動功能［12］。和所有脊椎動物一樣，斑馬魚的心臟是胚胎發(fā)育過程中第一個形成并發(fā)揮作用的器官。斑馬魚心臟發(fā)育的初始階段包括心肌細胞祖細胞的分化、遷移和分化。因為保存了早期心臟發(fā)育的分子機制，斑馬魚已成為研究脊椎動物心臟形成早期過程的一個很好工具［13-19］。斑馬魚幼魚運動行為測定方便快捷，能直觀反映幼魚的行為狀態(tài)和發(fā)育狀態(tài)，在毒理學和藥理學研究中被廣泛應用［23］。本實驗室利用DMSO作為助溶劑進行斑馬魚相關實驗時發(fā)現(xiàn)，其濃度≥0.30%時斑馬魚心率和運動行為與正常對照組相比均出現(xiàn)顯著性差異，這與現(xiàn)有文獻推薦的DMSO對斑馬魚胚胎的安全濃度≤0.5%存在差異。為避免在斑馬魚實驗助溶劑DMSO對實驗結(jié)果的干擾，有必要對安全性進行系統(tǒng)再評估。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMSO（美國ACROS公司）；50×E3培養(yǎng)液（NaCl 2.925 g，MgSO40.396 g，CaCl20.3663 g，KCl 0.1267 g，定容至1.0 L）、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和2X S6 SYBR Premix EsTaq plus（with Tli RNaseH）（北京賽音圖科技有限公司）。

斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技公司）；光學顯微鏡（日本尼康公司）；生化培養(yǎng)箱（一恒科學儀器有限公司）；斑馬魚行為學檢測系統(tǒng)（荷蘭Noldus公司）；LightCycler?96定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.2 實驗動物

野生型AB系斑馬魚為北京大學生命科學學院提供，由毒物藥物研究所斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)繁育。水溫約28.5℃，pH 6.5～7.5，電導率450～550 μs·cm-1，在黑暗與光照周期為10 h/14 h的條件下養(yǎng)殖，成年斑馬魚每日喂食豐年蝦幼蟲，早晚各1次。在暗周期開始前，將雌雄斑馬魚按1∶2比例放入專用交配魚缸中備用，加入循環(huán)養(yǎng)殖水并加隔板分開雌雄魚，用黑布遮蓋。隔天早上8∶00將黑布掀開給予光照，抽離隔板。在光刺激下雄魚追逐雌魚交尾，產(chǎn)卵15 min后收集受精卵。將魚卵置培養(yǎng)皿中，用養(yǎng)殖水輕柔沖洗掉未受精卵及糞便等雜物，清洗數(shù)次，置入生化培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 斑馬魚胚胎分組和處理

將受精后4 h的斑馬魚胚胎在顯微鏡下觀察，挑選出發(fā)育正常且處于囊胚期的胚胎。分為正常對照組及用E3孵化液稀釋的含DMSO終濃度（V/V）0.15%，0.30%，0.45%和0.60%組。每組25枚發(fā)育正常的胚胎，置6孔細胞培養(yǎng)板中，吸去多余液體。正常對照組加不含DMSO的E3孵化液，DMSO各濃度組分別加入上述所配各濃度溶液4 mL，置（約28.5℃）恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)暴露6 d。實驗過程中每24 h更換1次受試溶液，以保證溶液中各參數(shù)的穩(wěn)定。取來自不同親本的胚胎暴露處理，重復實驗3次。

1.4 記錄斑馬魚胚胎和幼魚心率

取1.3分組處理的斑馬魚胚胎，利用Noldus斑馬魚行為學分析系統(tǒng)分別記錄持續(xù)暴露于DMSO 2，3（胚胎和幼魚）和4 d（幼魚）后斑馬魚胚胎和幼魚的心率。

1.5 行為學實驗

將暴露4和6 d的DMSO組和正常對照組幼魚分別置96孔板中，每組各8條，每孔1條。將96孔板置Noldus斑馬魚行為學分析系統(tǒng)的暗箱中，使用Noldus行為學軟件采集3 min內(nèi)幼魚的運動軌跡，利用Etho Vision XT10軟件導出總游動距離和游動時間，計算幼魚游動速度和游動頻次，實驗重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR檢測胚胎和幼魚心臟發(fā)育和運動相關基因mRNA表達水平

取1.3分組處理的斑馬魚胚胎至1.5 mL離心管中，分別暴露2，4和6 d，盡量吸凈溶液。根據(jù)賽音圖試劑盒說明提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA稀釋后進行實時熒光定量PCR，檢測心房特異性肌球蛋白重鏈（atrium-specific myosin heavy chain，amhc）和心室特異性肌球蛋白重鏈（ventriclespecific myosin heavy chain，vmhc）基因表達變化，以及運動相關基因γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（4-aminobutyrate aminotransferase，abat），γ-氨基丁酸A型受體亞基α1（gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha1，gabra1）和谷氨酸脫羧酶1b（glutamate decarboxylase 1b，gad1b）表達變化。PCR引物（表1）由上海生工合成。RT-PCR反應體系為20 μL，反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，并在此步結(jié)束時收集熒光，45個循環(huán)；95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃ 1 s；37℃ 30 s。采用2-△△Ct定量目的基因mRNA相對表達水平。

Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，采用GraphPad Prism 9軟件分析。組間差異采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DMSO暴露對斑馬魚胚胎和幼魚心率的影響

與正常對照組相比，DMSO暴露2 d，心率變化無顯著性差異（圖1）；暴露3 d后，隨著DMSO濃度升高，心率逐漸降低，0.45%和0.60%組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；暴露4 d，0.30%，0.45%和0.60%DMSO組心率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），分別為165.1±1.2，158.8±4.4和（152.9±2.9）min-1。

Fig.1 Effect of dimethyl sulfoxide（DMSO）on heart rate of zebrafish embryos and juveniles.Zebrafish 4 h post-fertilization（4 hpf）were exposed to DMSO at percentage concentrations of 0.00%（normal control），0.15%，0.30%，0.45% and 0.60% for 2 d（embryos），3 d and 4 d（juveniles）.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control group.

2.2 DMSO暴露對斑馬魚幼魚運動行為的影響

DMSO暴露6 d，正常對照組斑馬魚幼魚游動活躍，游動距離較長；與正常對照組相比，0.45%和0.60%DMSO組游動時間和游動速度明顯縮短（圖2A～C）；0.15%DMSO組游動頻次和游動距離無顯著差異，0.30%，0.45%和0.60%DMSO組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01圖2D）。

Fig.2 Effect of DMSO on behavior of zebrafish juveniles.See Fig.1 for the exposed concentrations.4 hpf zebrafish embryos exposed to DMSO for 6 d.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 DMSO對斑馬魚胚胎和幼魚心臟發(fā)育相關基因amhc和vmhc mRNA表達的影響

與正常對照組相比，DMSO暴露2 d各濃度DMSO組，胚胎amhcmRNA表達水平無顯著性差異，但僅0.60%DMSO組vmhcmRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖3A）。暴露4 d，各濃度DMSO組斑馬魚幼魚amhc和vmhcmRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖3B）；暴露6 d，0.30%DMSO組amhcmRNA表達上調(diào)（P＜0.05），0.15%，0.45%和0.60%DMSO組amhc和vmhcmRNA表達均顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖3C）。

Fig.3 Effect of DMSO exposeure on mRNA expressions of amhc and vmhc in zebrafish embryos and juveniles.See Fig.1 for the exposed concentrations.4 hpf zebrafish embryos were exposed to DMSO for 2（A），4（B）and 6 d（C）.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 DMSO對斑馬魚胚胎和幼魚運動相關基因gad1b，gabra1和abat mRNA表達的影響

與正常對照組相比，DMSO暴露2 d，DMSO各濃度組gad1bmRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.01，圖4A），0.45%DMSO組gabra1mRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.05），0.15%DMSO組abatmRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.01），而 0.45% 和 0.60%DMSO 組abatmRNA表達顯著下降（P＜0.01）。暴露4 d，DMSO各濃度組gad1b，gabra1和abatmRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖4B）。暴露 6 d，gad1bmRNA表達均顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖4C），0.60%DMSO組gabra1mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.01），0.15，0.45和0.60%DMSO組abatmRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.01，圖4C）。

Fig.4 Effect of DMSO exposure on mRNA expressions of gad1b，gabra1 and abat in zebrafish embryos and juveniles.See Fig.1 for the exposed concentrations.4 hpf zebrafish embryos were exposed to DMSO for 2（A），4（B）and 6 d（C）.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DMSO濃度≥0.30%時，斑馬魚幼魚心率下降較明顯，隨著暴露劑量的增加和暴露時間的延長，幼魚的心率逐漸降低。amhc對心房功能至關重要，是收縮器的腔室特異性成分，構(gòu)成了胚胎心房的獨特功能屬性，也決定心房形狀、大小以及組織結(jié)構(gòu)［16］。只在心房中表達的amhc表達變化直接影響心房的收縮［20］。本研究結(jié)果顯示，暴露4 d時，DMSO各濃度組幼魚amhcmRNA表達顯著下降，暴露6 d時，幼魚amhcmRNA表達升高顯著。DMSO對幼魚amhcmRNA的表達的影響會進一步影響心房發(fā)育，并對心房產(chǎn)生毒性。

心房功能的喪失會影響胚胎的心室形態(tài)［21］。vmhc基因最初表達于斑馬魚前外側(cè)中胚層，之后其表達局限于心室［22］。本研究結(jié)果顯示，DMSO暴露2 d時，0.60%DMSO組vmhcmRNA表達下降顯著；暴露4 d時，DMSO各濃度組vmhcmRNA表達顯著下調(diào)；暴露6 d時，DMSO各濃度組vmhcmRNA顯著上調(diào)。表明DMSO對amhcmRNA表達的影響大于對vmhcmRNA表達的影響，提示DMSO對心房的影響可能大于對心室的影響，其具體的調(diào)控機制要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，DMSO暴露6 d時，隨著DMSO濃度的增高，幼魚的游動速度和游動距離逐漸減小，0.45%和0.60%DMSO對斑馬魚幼魚的運動行為有明顯抑制作用。暴露2，4和6 d，gad1bmRNA表達下調(diào)，且隨DMSO濃度升高而逐漸降低，與斑馬魚幼魚的運動行為減弱相一致。暴露2 d時，DMSO各濃度組gabra1mRNA表達均下調(diào)，且隨DMSO濃度的升高而降低。暴露4 d時，DMSO各濃度組gabra1mRNA表達均顯著下調(diào)。而暴露6 d時，DMSO各濃度組gabra1mRNA表達略有上調(diào)，只有0.60%組上調(diào)具有統(tǒng)計學意義。配體通過受體起作用，神經(jīng)相關受體的表達直接影響到神經(jīng)行為，gabra1受體被激活后，可選擇性地讓Cl-通過，引起神經(jīng)元超極化，這種超極化引起了神經(jīng)信號傳遞抑制，可能與運動行為下降有關。暴露2 d時，0.15%DMSO組abatmRNA表達上調(diào)，其他各組均下調(diào)，0.45%和0.60%組abatmRNA表達均下調(diào)。暴露4 d時，各組abatmRNA表達均顯著下調(diào)。暴露6 d時，各組abatmRNA表達均上調(diào)。abatmRNA上調(diào)應使γ-氨基丁酸含量下降，從而使運動行為增強，但本實驗中0.60%DMSO組表達上調(diào)，表現(xiàn)的卻是運動行為減弱，其原因還需進一步研究。

綜合上述各基因的表達情況表明，斑馬魚的運動行為受DMSO影響，且隨著濃度升高，運動能力下降，與γ-氨基丁酸受體系統(tǒng)上下游各基因的表達密切相關，其基因相互作用的調(diào)控關系需進一步研究。同時提出DMSO在斑馬魚實驗中，作為助溶劑，應該考慮到對心臟和神經(jīng)的毒性，在保證溶質(zhì)溶解的前提下，DMSO的濃度應低于0.30%，并要做好相應的實驗對照。