應用毒性評價軟件工具和Toxtree軟件預測硝基烴及其衍生物的毒性

賀泳迪，宋金甌，武 斌，王曉文，謝繼標，王 斌

（1.天津大學內燃機燃燒學國家重點實驗室，天津 300072；2.南華大學附屬懷化醫院，湖南 懷化 418000）

硝基烴是一類廣泛存在于燃燒裝置尾氣及城市大氣中的有毒物質，具有一定的一般毒性、致癌性、致畸性和致突變性，被認為經由燃燒尾氣中的氮氧化物和不完全燃燒產物之間的反應生成［1-4］。由于硝基為吸電子基團，硝基烴及其衍生物一般具有較大的偶極矩、極性和分子間吸引力，液態化合物的沸點一般較高；硝基烴在中高溫度條件下會進一步反應，被認為是復雜的醚、醇和醛等物質的前驅物，也可進一步還原生成亞硝基物、羥胺、亞胺和胺［5-6］。在工業上一般通過烷烴的氣相或液相硝化制取硝基烴，進而以硝基烴為底物加工生成其衍生物，目前可生產的硝基烴衍生物多達2000余種。目前排放標準日漸嚴格化，提高了對硝基烴等特殊污染物的關注，國內外在化學反應動力學層面針對硝基烴及其衍生物均展開了廣泛研究［5-9］；同時，硝基烴及其衍生物作為燃油添加劑［7］、藥品［10］和化學合成前體［11］的應用越來越廣泛。但針對硝基烴及其衍生物毒性、致癌性和致突變性的研究有限，僅有6-硝基聯苯和1-硝基芘等十余種硝基烴被國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）納入第二類致癌物名錄，大量同類物質，尤其是可能于中高溫環境下形成的硝基醇和硝基醛等物質，未見實驗報告。因此，亟需推進對該類物質的危害性研究，并建立毒性數據庫，以保障實驗室防護和生產防護等需要。

毒性評價軟件工具（Toxicity Estimation Software Tool，TEST）是世界范圍內應用最為廣泛的免費毒性預測軟件之一，具有多種化學品導入方法和毒性預測方法：①可通過輸入化學文摘（chemical abstract service，CAS）登記號、SMILES碼和系統命名名稱等常見信息查找化學物，或直接使用軟件內置的二維結構圖編輯器繪制特定化學品的結構，整體便捷、快速；②內置查詢數據庫，可實現離線查詢；③用戶可自主選擇需調用的毒性預測方法，軟件提供了層次法、最近鄰法和一致法等6種方法以供選擇，避免了單一方法的局限性；④可基于化學物質的結構特征自動計算分子描述符，采用所選方法預測毒性；⑤可量化評估急性毒性，可預測帶鰷魚（fathead minnow）半數致死濃度（lethal concentration 50%，LC50）、大型蚤（Daphnia magna）LC50、梨形四瓣蟲（Tetrahymena phriformis）半數生長抑制濃 度（inhibition growth concentration 50%，IGC50）、大鼠經口半數致死量（lethal dose 50%，LD50）、發育毒性、致突變性、生物富集因子和部分理化性質，在諸多基于定量結構活性關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）的毒性預測軟件中有較高的預測覆蓋性（涵蓋多種雜環類和大分子物質）。

Toxtree是基于決策樹的推理模型，可通過直接輸入SMILES碼、系統命名名稱查詢化學物質，或采用系統自帶的二維結構圖編輯器繪制化合物結構；界面簡單，使用快捷，內存占用小，預測覆蓋性良好，各步基于規則的預測推理均有透明報告，包含多個經實驗檢驗的決策樹；基于特定化合物結構，用戶可選用特定決策樹預測化合物毒性關注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）、致癌性、致突變性（包括Ames實驗和嚙齒類微核實驗）、皮膚腐蝕性和眼刺激性等。TTC是一項為化學品制定的人體暴露水平閾值，當人體攝入量低于該閾值，則一般認為難以造成健康危害［12］。TTC法常被用于預測化學品毒性、初步評價化學品危害性、評估相關動物實驗必要性和優先性等［12］。Toxtree提供了多個預測TTC的決策樹，如Cramer決策樹、擴展的Cramer決策樹、修訂的Cramer決策樹和Kroes決策樹等。Toxtree對于不飽和羰基化合物毒性預測效果不佳［13］，但對于結構復雜糖類、苷類、醌類和萜類化合物的致癌性和遺傳毒性預測具有良好靈敏性和準確性［14］。

此2種毒性預測軟件在國內已被多次用于復雜有機物（如中草藥有效成分）的毒性預測［12，14-17］、農業污染物毒性評估［18-19］等，適合于QSAR預測毒性數據庫的快速建立，但基于兩者毒性預測應用研究在國內仍有限，硝基烴及其衍生物數量數以千計，其危害性檢測依賴于大量動物實驗，難以在短期內一一檢測，因此，基于QSAR毒性預測軟件的快速預測尤為重要。

鑒于目前針對硝基烴及其衍生物危害性動物實驗仍較不足，本研究采用此2種常用毒性預測軟件預測硝基烴及其衍生物急性經口毒性、發育毒性、致突變性和致癌性，為建立QSAR預測毒性數據庫的提供預測數據，為后續動物實驗，以及相應實驗室防護和生產防護提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所選用硝基烴及其衍生物來源于Aladdin和MACKLIN 2個常用的化學品商用平臺，在上述平臺在售化學品名錄中，共調研得此類物質1200余種，鑒于TEST軟件對官能團種類較少物質預測準確度較高［18］，且目前對含有多種官能團硝基烴衍生物研究和應用均相當有限，從1200種硝基烴及其衍生物中篩選出硝基烴及除硝基官能團外僅含有一種官能團的硝基烴衍生物（如鄰硝基苯酚，僅含有硝基官能團和羥基官能團）共計449種，為本研究的研究對象，記錄入數據庫。其中文名稱、英文名稱和CAS登記號等信息均來源于對應平臺。數據庫的建立結構參考高雅等［15］的建設模板。根據硝基烴及其衍生物不同的結構及官能團，所選用硝基烴及其衍生物可分為15類，即①硝基烴46種；②硝基烴鹵代物103種；③硝基醇類化合物13種；④硝基酚類化合物25種；⑤硝基醚類化合物27種；⑥硝基醛類化合物6種；⑦硝基酮類化合物10種；⑧硝基羧酸類化合物31種；⑨硝基酯類化合物39種；⑩硝基腈類化合物16種；[11]含氮/含硫雜環硝基衍生物37種；[12]硝基胺/肼類化合物38種；[13]硝基酰胺/酰肼/酰氯類化合物19種；[14]帶含硫官能團的硝基物質23種；[15]其他物質16種，包含呋喃、酸酐、腙類等物質的硝基衍生物。

1.2 預測方法

TEST（Version 5.1）［20］由美國環境保護局（US Environmental Protection Agency，US EPA）開發，在本研究中用于預測物質的經口急性毒性（大鼠經口LD50）、發育毒性和致突變性（Ames實驗）。對急性經口毒性的定量預測，TEST提供了層次法、最近鄰法和一致法，其中一致法預測結果為采用其他方法預測結果的均值，可平衡不同方法優缺點，保證預測結果最優化［16］。因此本研究采用一致法。對于致突變性和發育毒性的預測，TEST僅給出定性預測結果（陰性/陽性）。其中對于致突變性預測TEST提供了層次法、最近鄰法和一致法；對于發育毒性預測TEST提供了層次法、最近鄰法、單一模型法和一致法，本研究均采用一致法。特殊情況下，對某些結構較為復雜物質，層次法或最近鄰法若失效，此時僅記錄其他方法的預測結果（如預測LD50時，如層次法失效，則僅記錄最近鄰法的預測結果）。待分析物質通過CAS登記號進行導入，對于TEST內置數據庫內未記錄物質，采用二維結構圖編輯器繪制結構。預測過程采用嚴碎片約束算法，不進行Relax Fragment Constraint優化。

Toxtree（Version 3.1.0）由歐盟聯合研究中心（Joint Research Centre，JRC）開發，在本研究中用于預測物質的TTC、遺傳毒致癌性結構預警（genotoxic carcinogenicity structural alert，GC SA）、非遺傳毒致癌性結構預警（nongenotoxic carcinogenicity structural alert，NGC SA）和致突變性（Ames實驗）。對于TTC預測，Toxtree內置了修訂的Cramer和Kroes TTC等多個決策樹，本研究采用簡潔、常用的修訂Cramer決策樹；對于致癌性預測，本研究采用內置的“通過判別分析和結構規則預測致癌性/致突變性概率（predicts the possibility of carcinogenicity and mutagenicity by discriminant analysis and structural rules）”決策樹；對于致突變性預測，本研究采用內置的“ISS體外誘變警報〔in vitromutagenicity（Ames test）alerts by ISS〕”決策樹。各決策樹在預測前未做修改。待分析物質通過輸入物質系統命名名稱導入，對于內置數據庫未能識別的物質，通過二維結構圖編輯器繪制結構。

1.3 統計學分析

對不同結構的硝基烴及其衍生物的急性毒性采用全球化學品統一分類和標簽制度分類法（Globally Harmonized System，GHS）和Hodge/Sterner（H/S）分類法進行分類，對分類結果進行有序分類變量的秩和檢驗統計學分析，以明確各結構分類的物質的大鼠經口LD50在GHS和H/S急性毒性分類中的差異是否具有統計學意義。鑒于本研究同時采用TEST和Toxtree 2個軟件預測了致突變性（Ames實驗），對于2個軟件的定性預測結果進行Kappa一致性檢驗。部分研究報告了硝基烴或其衍生物的大鼠經口LD50的實驗值及相應急性毒性分類，對于同一物質大鼠經口LD50所屬毒性分類的預測值和實驗值進行Kappa一致性檢驗。當Kappa值介于0～0.4之間時，認為一致性較差；介于0.4～0.75之間時，認為一致性一般；介于0.75～1.0之間時，認為一致性較好。

對于致突變性和致癌性等陰性/陽性分類型數據，基于貝葉斯逆概率定律，主要的評價指標采用Cooper統計量［15，21］，包括靈敏性、特異性和準確性。其中，靈敏性=預測值和實驗值均為陽性的樣本數/實驗值為陽性的樣本數，特異性=預測值和實驗值均為陰性的樣本數/實驗值為陰性樣本數，準確性=預測值和實驗值一致的樣本數/總樣本數。急性毒性分類計算準確率（%）=實驗值和預測值毒性分類一致樣本數/總樣本數的比率×100%。

2 結果

2.1 軟件預測結果

修訂的Cramer決策樹根據29個化學結構特點將化學品分為3類，即Ⅰ類物質（結構簡單，存在有效代謝途徑）、Ⅱ類物質（其結構對應的無害性次于Ⅰ類物質，但不存在Ⅲ類物質的結構特點）和Ⅲ類物質（存在不可推定為安全的結構特點或含有高反應活性的官能團，可能存在顯著毒性）。由于修訂的Cramer決策樹將硝基官能團認定為一種加強毒性的官能團（functional group associated with enhanced toxicity），本研究中數據庫中449種硝基烴及其衍生物均被Toxtree認定為毒理學關注閾值Ⅲ類物質，即均不可預設為安全的物質，可能具有顯著的經口毒性［22］。

本研究選用的2種急性毒性分類方法中，GHS分類法中將毒性分為5類，大鼠經口LD50分別為第1類0～5 mg·kg-1，第2類5～50 mg·kg-1，第3類50～300 mg·kg-1，第 4 類 300～2000 mg·kg-1，第5類≥2000 mg·kg-1；H/S分類法則分為6類，大鼠經口LD50分別為極毒0～1 mg·kg-1、高毒1～50 mg·kg-1、中毒50～500 mg·kg-1、低毒500～5000 mg·kg-1、基本無毒5000～15 000 mg·kg-1和相對無害≥15 000 mg·kg-1）。TEST對大鼠經口LD50的預測結果（圖1，表1）顯示，298種（66.4%）硝基烴及其衍生物的大鼠經口LD50屬GHS急性毒性第4類，104種（23.2%）屬GHS急性毒性第5類；354種（78.8%）硝基烴及其衍生物大鼠經口LD50預測值屬H/S分類法“低毒”類，82種（18.3%）屬H/S分類法“中毒”類。絕大多數硝基烴及其衍生物屬中低毒性物質。1-硝基-2，5-雙三氟甲基苯、4-叔丁基-2，6-二硝基苯酚、4-（硝基芐基）膦酸二乙酯、6-硝基吲哚、3-硝基-7-氮雜吲哚和3-硝基鄰苯二甲酰肼的大鼠經口LD50預測值顯示，屬H/S分類法的高毒物質（或GHS急性毒性第2類物質），表明在相應實驗室使用和生產過程中需著重注意防護工作。對不同結構分類的硝基烴及其衍生物的LD50的GHS分類進行有序多分類樣本比較秩和檢驗，表明不同結構分類的硝基烴及其衍生物急性毒性分類預測差異具有統計學意義（P＜0.01）。

Fig.1 Dot plot of results of acute oral toxicity of nitro-organic compounds predicted by Toxicity Estimation Software Tool（TEST）.Dots in the figure represent the oral rat LD50data predicted by TEST.Data points in Fig.1A and Fig.1B are located in the same positions.Fig.1（A）and Fig.1（B）show the toxicity classifications according to Globally Harmonized System（GHS）standard and Hodge/sterner（H/S）standard，respectively.

Tab.1 Predicted results of acute toxicity classifications（LD50），developmental toxicity，mutagenicity and carcinogenicity of nitro-organic compounds

TEST和Toxtree軟件對不同結構分類的硝基烴及其衍生物的發育毒性、致突變性（Ames實驗）、GC SA和NGC SA預測結果見表1。由于本研究的分析對象中脂鏈硝基烴（及其衍生物）僅占3%，大多數導入預測軟件的硝基烴及其衍生物均為硝基芳烴的衍生物或含氮/含硫雜環物質的硝基衍生物，而Toxtree內置的“通過判別分析和結構規則預測致癌性/致突變性概率”決策樹將硝基苯結構認定為遺傳毒致癌性結構和致突變性結構之一，因此396種（88.2%）硝基烴及其衍生物的預測結果（表1）顯示有GC SA，396種（88.2%）被Toxtree提示有Ames實驗致突變性結構預警。對于部分結構特殊的硝基烴及其衍生物，如硝基官能團的鄰位均有取代基（如2，6-二氟硝基苯），或硝基官能團的鄰位存在羧酸取代基，或硝基官能團所在環上存在磺酸基團時，前述決策樹將排除此類物質的GC SA和致突變性結構預警。此類硝基烴及其衍生物的預測結果未顯示致癌性陽性或致突變性陽性。少數硝基烴及其衍生物具有鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二酯、咪唑、苯并咪唑、二甲酰亞胺和鄰苯基苯酚等結構，此類結構被前述決策樹認為具有不涉及DNA損傷的致癌模式，被Toxtree預測為具有非遺傳毒致癌性，因此僅13種（2.9%）硝基烴及其衍生物的預測結果顯示有NGC SA。

被TEST預測為致突變性陽性的硝基烴及其衍生物有284種，占全部物質的63.3%，而被Toxtree預測為致突變性陽性的物質有396種（88.2%）。2個軟件對于285種（63.5%）物質的預測結果一致；在被TEST預測為致突變性陽性的硝基烴及其衍生物中，258種（占比90.8%）同樣被Toxtree預測為致突變性陽性，2個軟件在陽性預測上一致性較高。相較于TEST致突變性預測中結合最近鄰法和層次法的預測邏輯，Toxtree的“ISS體外誘變警報”決策樹簡單地將硝基苯結構認定為致突變性結構，僅根據碎片結構進行預測，導致其在致突變性預測中相比于TEST更為嚴格，因此，有137種硝基烴及其衍生物被TEST預測為致突變性陰性，但被Toxtree內置決策樹提示具有致突變性結構預警。相對于TEST，Toxtree的預測邏輯較為武斷，導致Toxtree和TEST對于致突變性的預測一致性較差（Kappa系數=0.09）。綜合2個軟件的預測結果，數據庫中442種（94.0%）硝基烴及其衍生物被記錄為致突變性陽性。

213種（47.4%）硝基烴及其衍生物的TEST預測結果為發育毒性陽性，其中，硝基烴（60.9%）、硝基醚類（74.1%）、硝基酯類（64.1%）和帶含硫官能團的硝基物質（65.2%）的發育毒性陽性率均達60%。

硝基烴大鼠經口LD50、發育毒性、致突變性和致癌性的預測結果（表2）顯示，苊、芴、萘、聯苯和萘等PAH前驅物［23］的硝基衍生物的發育毒性和致突變性的預測結果基本均為陽性，所有此類物質均被Toxtree提示具有GC SA；相比于單硝基烴，結構相似的二硝基烴的大鼠經口LD50預測值明顯更高。

Tab.2 Predicted and experimental results of acute toxicity classifications（LD50），developmental toxicity，mutagenicity and carcinogenicity of nitro-hydrocarbons

Tab.2(Continued)

2.2 預測結果評價

ChemidPlus數據庫有大鼠經口LD50實驗數據的硝基烴及其衍生物共66種，對比大鼠經口LD50預測值和實驗值，結果（圖2，表3）顯示，大鼠經口LD50的實驗值為TEST預測值的0.01～16.39倍，33種（50.0%）硝基烴及其衍生物的預測相對誤差在±50%以內，22種（33.3%）物質的預測相對誤差在±30%以內；對于部分取代基復雜的物質，如5-硝間苯二甲酸二甲酯和雙（4-硝苯）硫醚，預測誤差較大；40種（60.6%）硝基烴及其衍生物的LD50預測值和實驗值所屬的GHS急性毒性分類一致，49種（74.2%）物質預測值和實驗值所屬的H/S急性毒性分類一致，整體預測準確率尚可。LD50預測值和實驗值所屬的GHS急性毒性分類的一致性不佳（Kappa系數=0.28），對于H/S急性毒性分類的一致性一般（Kappa系數=0.56），明顯優于GHS分類。ChemidPlus數據庫中有Ames實驗數據的硝基烴及其衍生物共151種，TEST預測致突變性（Ames實驗）的靈敏性、特異性和準確性（Cooper統計量［15，21］）分別為86.6%，63.2%和80.7%，Toxtree預測的靈敏性、特異性和準確性分別為93.8%，21.1%和75.5%，Toxtree對致突變性的預測呈現低特異性的原因如上文所述；Lhasa數據庫中有致癌性實驗數據的硝基烴及其衍生物共27種，Toxtree預測的靈敏性、特異性和準確性分別為84.2%，62.5%和77.8%。由于各QSAR平臺、數據庫對于發育毒性的評價標準不一，通常難以給出可靠性評價［14］。

Fig.2 Dot plot of oral rat LD50of nitro-organic compounds predicted by TEST（hollow circles）and reported in literature（solid squares）.

Tab.3 TEST predictions and experimental values reported in literature on oral rat LD50of nitro-organic compounds

Tab.3(Continued)

對于46種硝基烴的大鼠經口LD50（表2），除硝基甲烷（LD50預測值 3138.51 mg·kg-1，實驗值941.21mg·kg-1）、硝基乙烷（LD50預測值553.02mg·kg-1，實驗值1100.33 mg·kg-1）、2-硝基聯苯（LD50預測值1908.01 mg·kg-1，實驗值1231.21 mg·kg-1）和 1，3-二硝基苯（LD50預測值201.21 mg·kg-1，實驗值59.51 mg·kg-1）外，硝基烴的預測相對誤差均＜40.0%；其中，1-硝基丙烷、硝基苯、鄰硝基甲苯等常用硝基烴的預測誤差＜10.0%。硝基烴大鼠經口LD50的預測值和實驗值所屬的H/S急性毒性分類的一致性較好（Kappa系數=0.85）；TEST和Toxtree軟件對硝基烴致突變性的預測準確性均為67.9%。

綜上所述，除Toxtree預測致突變性特異性不佳外，TEST和Toxtree整體預測可靠性尚佳，優于同類數據庫的評估結果［14］。

3 討論

針對硝基烴及其衍生物的致毒、致病機制，目前存在多種說法，但均與硝基官能團緊密相關。魏桐等［24］和閆秀芬等［25］提出，與體內蛋白形成共價加合物是硝基烴的重要致毒機制之一。對于加合物的生成機制，目前尚有不同觀點：①單電子還原酶作用促進硝基自由基的形成，進而啟動氧化應激機制；②雙電子還原酶促使硝基烴生成亞硝基產物。該毒性機制被認為與硝基官能團自身的強氧化性、親電性，電荷和前線軌道能級差［25-26］以及C-N鍵的低鍵能有關。硝基烴及其衍生物均帶有硝基官能團，可能廣泛存在上述致毒機制。本研究預測結果同樣顯示，絕大多數（98.4%）硝基烴及其衍生物具有低毒及以上的急性經口毒性，多硝基物質的急性經口毒性預測值明顯高于具有類似結構的單硝基物質。此外，本研究預測結果顯示，硝基胺類的急性經口毒性普遍較低，由于苯環上的氨基則增加苯環和硝基上的負電性［25］，進而使急性經口毒性降低。

Yin等［27］針對鹵代硝基烴的研究表明，鹵代硝基甲烷可誘導氧化應激，進而造成DNA損傷，誘導細胞凋亡，但是在胃腸道的快速脫鹵將導致其急性經口毒性快速降低；與此對應，本研究發現，79.6%硝基烴鹵代物的急性經口毒性預測結果為低毒，大多數硝基烴鹵代物表現出的低毒性可能與上述胃腸道脫鹵機理有關；預測結果顯示，86.4%硝基烴鹵代物被Toxtree提示有GC SA，94.2%硝基烴鹵代物為致突變性陽性，這一定程度表明，本研究所分析的大分子鹵代硝基烴，也存在與鹵代硝基甲烷類似的誘導氧化應激，進而造成DNA損傷，誘導細胞凋亡的致癌、致突變機制。

綜上所述，由于硝基官能團的存在，硝基烴及其衍生物可能普遍存在一定急性經口毒性，其毒性大小與硝基官能團的數量、電荷、前線軌道能級差、所對應C-N鍵鍵能有關；硝基烴鹵代物可能會導致DNA損傷，表現為致突變性和致癌性；鹵代官能團和氨基官能團的引入可能使急性經口毒性下降。而其他硝基烴及其衍生物的風險評估仍需進一步的實驗毒理學、計算化學研究。

由本研究預測結果可見，大部分硝基烴及其衍生物具有急性經口毒性，相當一部分硝基烴及其衍生物具有致癌性和發育毒性，這與目前學界對于硝基烴的共識一致。但需要注意的是，一部分硝基烴及其衍生物具有中高毒性，包括目前應用廣泛的吸熱碳氫燃料引發劑硝基丙烷［5-7］和常見于大氣中的二硝基取代芳烴，在這些物質的生產流程及其排污后處理過程中需要著重注意硝基烴及其衍生物的檢測、處理，及對應的生產防護；鑒于硝基烴來源于碳氫污染物和氮氧化物之間的反應［1-4］，來源尤為廣泛，預測結果顯示的廣泛存在的急性經口毒性表明，對此類物質進行針對性的大氣監測具有必要性；預測結果提示硝基烴及其衍生物在發育毒性方面存在高發性，Kroes等［22］和高雅等［16］曾提出，發育毒性與致畸性具有較強的相關關系，因此，需要開展進一步的致畸性、發育毒性研究。綜上所述，硝基烴及其衍生物預測結果顯示的高發存在的中高急性經口毒性、致癌性、致突變性和發育毒性表明了展開進一步化學、毒理學研究的必要性，同時也為風險評估提供了重要參考；TEST和Toxtree整體上的預測準確性一定程度上表明了基于該2個QSAR預測軟件進行硝基烴及其衍生物的危害性評估的可行性，但對于部分取代基復雜的衍生物，預測準確性仍較為有限。