豬流行性腹瀉病毒德州株的分離鑒定及ORF3基因遺傳進化分析

張榮武

(山東省德州市陵城區畜牧獸醫服務中心 ， 山東 德州 253000)

仔豬腹瀉性疾病是豬養殖業常見的疾病，該病是導致仔豬大量死亡的主要原因之一，臨床中引起仔豬腹瀉的病毒性疾病主要有豬流行性腹瀉(PED)、豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬輪狀病毒病(PoR)等，其中PED具有導致仔豬死亡率高、病情傳播快速、群發性強、難以控制的特點，是引起仔豬腹瀉死亡的主要病毒性疾病[1-2]。PED是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起不同階段豬發病的一種急性傳染性疾病，該病以嘔吐、水樣腹瀉、脫水等為主要臨床特征，也稱為“冬季拉稀病”，其中以哺乳豬發病率最高，死亡率高達100%，在我國豬場中廣泛流行，給養豬業造成嚴重的經濟損失[3-5]。

PEDV為單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，該病毒基因組長28 kb，基因組中編碼7個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)蛋白，主要包括5個結構蛋白和2個非結構蛋白,其中ORF3基因編碼的ORF3蛋白位于S蛋白和E蛋白之間[6]。研究表明，ORF3 蛋白的缺失可以導致PEDV毒力降低或者弱化，但不影響病毒在體內的增殖與復制[7-8]。因此，對PEDVORF3 基因進行序列分析，可以間接分析該病毒株毒力的強弱，在臨床中具有重要的意義。

2020年11月，本試驗在德州地區養殖場中采集患腹瀉仔豬的小腸組織內容物樣品12份，進行PEDV分離鑒定，并對分離的PEDVORF3基因進行核苷酸序列分析，為PEDV的進一步防控及疫苗研發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2020年11月，在德州地區養殖場中采集患腹瀉仔豬的小腸組織內容物樣品12份。

1.2 主要試劑 Vero傳代細胞系，由山東農業大學獸醫學院傳染病實驗室提供；抗PEDV S 蛋白單克隆抗體(mAb)，購自北京華研世佳質檢科技有限公司；FITC標記山羊抗鼠抗體，購自北京百奧萊博科技有限公司；DL2 000 Marker、ExTaqDNA聚合酶、病毒RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒，均購自大連TaKaRa公司；pMD-18T載體、細胞培養板、胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、雙抗，均購自美國Gibco公司。

1.3 病毒性疾病的PCR檢測 參照參考文獻[9-12]報道的方法，提取采集的病料組織的基因組，采用PCR/RT-PCR 方法對豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬Delta冠狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒等病原進行檢測。

1.4 病毒的分離培養和形態學觀察 將PEDV檢測陽性的組織加入適量的無菌PBS勻漿，-80 ℃反復凍融3～5次，12 000 r/min離心10 min，取上清過濾除菌，加入雙抗處理，取病料組織上清液100 μL接種到Vero細胞中，作為感染組，同時設不攻毒的對照組，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每日觀察細胞狀態。盲傳至4～5代，接毒Vero細胞出現85%的細胞病變效應(CPE)后收毒，-80 ℃低溫冰箱保存備用。取出現CPE的Vero細胞進行收毒，離心取上清，用20 g/L的磷鎢酸負染后，將樣品送山東農業大學電鏡室，通過電鏡觀察病毒形態。

1.5 病毒的半數組織培養感染劑量(TCID50)測定 參照參考文獻[9]報道的方法，將分離的PEDV株第5代(F5)病毒用DMEM培養液做10倍倍比稀釋培養，按Reed-Muench法計算TCID50。

1.6 病毒的RT-PCR鑒定 用病毒RNA提取試劑盒提取Vero細胞培養物基因組RNA，反轉錄為cDAN進行PCR鑒定，用PEDVM基因特異性引物(F:5′-CCTTACCCTAGACTTCAAGA-3′，R:5′-AAACCAGGGAAAAAAAGTACGA-3′)擴增，目的片段大小為370 bp。回收目的基因片段，連接到pMD-18T載體上，提取質粒進行測序。

1.7 病毒的間接免疫熒光(IFA)鑒定 參照參考文獻[13-14]報道的方法，將PCR檢測PEDV為陽性的F5細胞培養物上清液接種于新鮮培養的Vero細胞，作為感染組，同時設立對照組，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后進行IFA檢測，于倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

1.8 病毒的ORF3基因擴增與序列分析 參照參考文獻[9]，根據GenBank(登錄號：AF353511)中PEDV基因序列，設計ORF3基因引物(F:5′-CCTAGACTTCAACCTTACGA-3′，R:5′-CCAGGAAAAAAG-AGTACGAAAA-3′)，擴增目的片段大小為774 bp。對PEDV分離株的ORF3基因進行PCR鑒定，回收目的基因片段，連接到pMD-18T載體上，提取質粒進行測序。PEDV分離株的測序結果與GenBank中登錄的PEDV參考株ORF3基因序列進行同源比對，利用 DNASTAR 軟件構建系統進化發育樹，分析遺傳變異特點。

2 結果

2.1 病毒性疾病的PCR檢測 豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬Delta冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒的PCR檢測結果均為陰性，豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR檢測結果為陽性。

2.2 病毒的分離培養和形態學觀察 將PEDV檢測陽性樣品處理后，接種于Vero細胞進行病毒分離培養，感染組的Vero細胞在盲傳第5代(F5)時出現CPE，Vero細胞出現了萎縮、聚堆、脫落，個別的細胞出現腫脹、變形等(圖1A)，對照組的Vero細胞未見明顯的病變(圖1B)。將分離的PEDV病毒株命名為德州株(JIAOZUO101)。在電子顯微鏡下可見，德州株(JIAOZUO101)是直徑大約為100 nm的病毒粒子，具有明顯的囊膜和纖突，呈典型的冠狀病毒粒子形態(圖2)，與劉暢等[10]報道的PEDV形態學結構基本一致。經測定德州株(JIAOZUO101)傳至第5代時病毒滴度為104.6TCID50/mL。

圖1 德州株(JIAOZUO101) F5的Vero細胞病變(40×)Fig.1 Vero cell lesion of Dezhou strain (JIAOZUO101) F5 (40×)A:感染組; B：對照組 A:Infected group; B:Control group

圖2 德州株(JIAOZUO101)病毒粒子形態Fig.2 Morphology of virus particles of Dezhou strain (JIAOZUO101)

2.3 病毒的RT-PCR鑒定 RT-PCR鑒定結果如圖3所示，德州株(JIAOZUO101)的細胞培養物擴增出大小約370 bp的目的條帶，與預期大小相符。PEDV分離株測序結果與GenBank中登錄的PEDV參考株同源性介于97.0%～99.9%。結果表明，經RT-PCR鑒定德州株(JIAOZUO101)為PEDV。

圖3 德州株(JIAOZUO101)RT-PCR鑒定結果Fig.3 RT-PCR identification results of Dezhou strain (JIAOZUO101)M:DL2 000 DNA 相對分子質量標準； 1～2:細胞培養物； 3:空白對照M:DL2 000 DNA Marker; 1-2:Cell culture; 3:Blank control

2.4 病毒的IFA鑒定 結果如圖4所示，感染組的Vero細胞呈現特異性綠色熒光，對照組未見有特異性綠色熒光。

圖4 德州株(JIAOZUO101)IFA檢測結果(100×)Fig.4 IFA test results of Dezhou strain (JIAOZUO101) (100×)A:感染組； B：對照組A:Infected group; B:Control group

2.5 病毒的ORF3基因擴增與序列分析 用RT-PCR方法對PEDV德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因進行擴增，結果如圖5所示，德州株(JIAOZUO101)擴增出大小約為774 bp的目的條帶，與預期大小相符。德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因測序結果與GenBank中登錄的20株PEDV參考株ORF3基因的核苷酸序列的同源性介于 97.6%～99.9%。利用 DNASTAR軟件構建系統進化發育樹，并分析德州株(JIAOZUO101)ORF3基因遺傳變異特點。結果如圖6所示，德州株(JIAOZUO101)與Jiangxi 2017株、Henan 2015株位于同一支，遺傳距離較近，其同源性介于99.3%～99.9%，與其他18株參考株的遺傳距離較遠。德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因序列中只是個別堿基發生變化，編碼的氨基酸未發生缺失，未發生明顯變異。

圖5 德州株(JIAOZUO101)的ORF 3基因檢測結果Fig.5 ORF 3 gene detection results of Dezhou strain (JIAOZUO101)M:DL2 000 DNA 相對分子質量標準； 1～2:細胞培養物； 3:空白對照；M:DL2 000 DNA Marker; 1-2:Cell culture; 3:Blank control

圖6 德州株(JIAOZUO101)的ORF 3基因系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of ORF 3 gene of Dezhou strain (JIAOZUO101)▲:本試驗分離毒株 ▲:Strain isolated in this study

3 討論

PED是引起仔豬腹瀉病的主要病毒性疾病之一，豬是PEDV的唯一宿主，該病對仔豬極易感，且具有發病急、傳播快、死亡率高的特點，對豬具有很大的威脅[15]。國內外相關研究表明，PEDV在世界各地區廣泛分布流行，在我國的多個省區也廣泛流行[16-18]。PEDV侵害的部位主要在腸道，通過膜融合侵入細胞，在小腸絨毛上皮細胞中增殖與復制，引起腸道病變，同時通過糞便和分泌物排出體外，感染其他動物，仔豬的發病日齡越小，其死亡率越高[9-11]。因此，加強PED流行病學監測，對減少該病的發生與流行具有重要意義。本試驗從患腹瀉仔豬的小腸組織內容物樣品中分離得到1株PEDV，命名為德州株(JIAOZUO101)。對該毒株的ORF3基因擴增并分析其遺傳變異情況，結果顯示，PEDV德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因序列與Jiangxi 2017株、Henan 2015株同源性較近，且未發生變異情況。臨床中PED的預防主要通過疫苗免疫，近幾年，PEDV已經出現變異情況，導致其疫苗不能有效地保護豬群免受感染，分析PEDV是否變異，在臨床為該病的流行病學及綜合防控具有重要的意義[4-6]。因此，在臨床中應該注重綜合防控，定期免疫和消毒凈化，才能有效控制PED的發生與流行。本試驗為進一步的PED防控及疫苗研發提供理論參考。