河南焦作地區肉種雞場沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析

杜海霞 ， 朱平軍 ， 婁福麗 ， 王夢艷

(1.周口職業技術學院 , 河南 周口 466000 ； 2.商水縣動物衛生監督所 , 河南 周口 466000 ；3.河南省焦作市溫縣農林局 , 河南 焦作 454850)

雞沙門菌病是危害雞養殖業較嚴重的疾病之一，也是臨床中常見的細菌性疾病。可感染雞的沙門菌主要有雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌等多種血清型，其中雞白痢沙門菌對幼雛危害較大，其發病率和死亡率均較高，可引起產蛋雞的產蛋率下降，該菌可以通過多種途徑傳播，也可垂直傳播給子代，人食用被沙門菌污染的食品，可引發食物性中毒和食源性疾病，該菌不僅給養雞業帶來重大損失，同時也嚴重威脅公共衛生安全[1-5]。目前，在臨床中雞沙門菌血清型眾多，傳播方式多樣，沒有有效疫苗可以預防，主要依靠抗菌藥進行治療與預防，隨著抗菌藥物的不合理使用，導致出現耐藥性及藥物殘留等一系列問題，尤其是殘留藥物可以通過多種途徑傳播給人類，對人類的健康造成潛在的威脅，同時由于耐藥性的產生，給臨床中沙門菌病的治療帶來更多的困難[6-7]。因此，臨床中應該對雞沙門菌病進行凈化，減少該病的發生與流行，同時開發替抗添加劑具有重要的意義。本試驗于2017—2019年采集肉種雞場疑似沙門菌病例的組織、死胚和病死雛雞等病料組織572份，進行沙門菌分離鑒定并檢測其耐藥性，為該地區的肉種雞場沙門菌的綜合防控和科學使用抗菌藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2017—2019年采集焦作地區肉種雞場中疑似沙門菌病例的組織、死胚和病死雛雞等病料組織572份。

1.2 主要試劑 沙門菌顯色鑒定培養基、蛋白胨水、沙門菌增菌液(TTB)、營養肉湯，均購自上海康朗生物科技有限公司；臨床中常用的16種抗菌藥藥敏紙片，購自杭州華康微生物試劑有限公司；2×TaqMaster Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購自北京中科瑞泰科技有限公司；沙門菌生化鑒定試紙條，購自青島海博生物科技有限公司。

1.3 細菌分離與鑒定 將采集的樣品進行無菌處理后，接種于沙門菌增菌液(TTB)，37 ℃、200 r/min振蕩培養8～12 h增菌后，在無菌條件下，取增菌液50 μL均勻接種于沙門菌顯色鑒定培養基，37 ℃恒溫條件下進行鑒別培養12～18 h，挑取沙門菌顯色鑒定培養基單個菌落進行純化培養，取純化培養的分離菌株進行染色鏡檢觀察其形態，按照沙門菌生化鑒定試紙條說明書對分離的純化培養的菌株進行生化特性鑒定。

1.4 細菌PCR鑒定 對生化鑒定為沙門菌的菌株，采用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，進行PCR鑒定。根據GenBank中沙門菌基因序列，參照參考文獻[8]設計沙門菌保守區引物invA(F:5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′；R:5′-AGAC-GACTGGTACTGATCGATAAT-3′),引物invA序列由深圳華大基因股份有限公司合成。沙門菌鑒定基因invA引物擴增片段的大小為241 bp，以提取的疑似沙門菌株的基因組DNA為模板，用鑒定引物invA進行PCR鑒定，挑取PCR檢測陽性的樣品進行測序，其測序結果與GenBank中公布的沙門菌序列進行同源性比對。

1.5 藥敏試驗 對臨床中分離獲得的沙門菌，參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行藥敏試驗和結果判斷[敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)],并分析分離菌株的耐藥性。

1.6 耐藥基因檢測 根據GenBank中公布沙門菌的耐藥基因序列，參照參考文獻[9-10]，用Primer 5.0設計耐藥基因引物，并由深圳華大基因股份有限公司合成。檢測的耐藥基因包括：β-內酰胺類耐藥基因(tem、cmy、shv)，磺胺類耐藥基因(Sul1、Sul2、Sul3)，氨基糖苷類耐藥基因[aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib]，喹諾酮類耐藥基因(gyrA、gyrB、qurS)，四環素類耐藥基因(TetA、TetM、TetR)，酰胺醇類耐藥基因(floR)，多肽類耐藥基因(mcr-1)。以1.4中提取的基因組DNA為模板對上述7類耐藥基因進行PCR擴增。

2 結果

2.1 細菌的分離與鑒定 在死胚和病死雛雞等病料組織分離得到的菌株，在沙門菌顯色鑒別培養基上長出大小一致、邊緣整齊、藍紫色的圓形菌落；對疑似沙門菌的菌株進行染色鏡檢，可見分離菌株呈現無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌；通過生化鑒定，分離的109株細菌均鑒定為沙門菌。

2.2 細菌PCR鑒定 用沙門菌鑒定引物invA對臨床分離的109株疑似沙門菌菌株進行PCR鑒定。結果顯示，從572份病料組織中分離得到109株沙門菌均可擴增出大小約為241 bp的目的條帶(圖1)。通過對菌株測序分析，臨床分離的109株沙門菌測序結果與GenBank中公布的參考株同源性介于97.9%～99.6%。表明分離的109株細菌從分子生物水平鑒定為沙門菌。

圖1 細菌PCR鑒定Fig.1 PCR identification of bacteriaM:DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1:空白對照； 2～9:分離菌株M:DL-2 000 DNA Marker; 1:Blank control; 2-9:Isolated strains

2.3 藥敏試驗 結果如表1所示，分離的109株沙門菌對阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、多西環素、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、氟苯尼考、多黏菌素共12種抗菌藥耐藥性較嚴重，耐藥率介于51.4%～100.0%；對頭孢噻呋、氧氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星4種藥物耐藥率較低，耐藥率介于11.0%～38.5%。由表2可知，臨床分離的109株沙門菌呈現多重耐藥性，分離菌株以耐12、11、10種藥物最多，分別占分離菌株總數的16.5%、17.4%和15.6%，說明該地區分離的沙門菌耐藥性嚴重。

表1 耐藥性檢測結果Table 1 Results of drug resistance test (n=109)

表2 多重耐藥性檢測結果Table 2 Results of multidrug resistance test

2.4 耐藥基因檢測 采用PCR方法對臨床中分離的109株沙門菌進行16種耐藥基因檢測。結果如表3所示，分離的109株沙門菌攜帶多種基因，其攜帶的耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3、aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib、TetA、TetM、TetR、floR、mcr-1檢出率介于51.4%～93.5%；耐藥基因tem、cmy、shv、gyrA、gyrB、qurS檢出率介于2.8%～33.0%。

表3 耐藥基因檢測結果Table 3 Results of drug resistance gene detection (n=109)

3 討論

禽類是沙門菌的攜帶者、傳播者及主要的感染宿主，沙門菌可以在不同禽類養殖過程中廣泛傳播，且傳播方式多樣，既能水平傳播，又能垂直傳播，尤其是種雞(種母雞)攜帶的沙門菌可通過卵傳播給下一代，也可以通過其他途徑傳染給其他健康雞，導致沙門菌在禽類養殖中廣泛流行[2-4]。沙門菌具有多種血清型且具有地區性，給疫苗研制帶來一定困難，也導致該菌在禽類養殖過程中廣泛流行[4-7]。本試驗于2017—2019年采集焦作地區肉種雞場中疑似沙門菌病例的組織、死胚和病死雛雞等病料組織572份，從中分離得到109株沙門菌，說明該地區的肉種雞場中沙門菌感染嚴重，存在潛在威脅。因此，對沙門菌進行凈化和防控具有重要的意義。

國內許多研究表明，從養雞場中分離的沙門菌具有很強的耐藥性，呈現多重耐藥性。羊揚等[6]研究表明，從廣西欽州地區采集的麻雞死胚分離得到164株沙門菌，其對磺胺異噁唑、四環素等抗菌藥耐藥性嚴重。吳曉君等[8]研究表明，從華東地區養雞場中分離的沙門菌對紅霉素、阿奇霉素、克林霉素等8種抗菌藥的耐藥率均超過50%。晏玲等[9]研究表明，從廣東黃羽肉種雞場死胚中分離的雞白痢沙門菌對磺胺異噁唑、萘啶酸、氨芐西林、四環素耐藥率均較高，且均呈現多重耐藥性。本試驗顯示，分離的109株沙門菌對常用的抗菌藥均產生很強的耐藥性。說明沙門菌耐藥性普遍存在，應該引起重視，注意抗菌藥的合理使用。沙門菌耐藥性的產生不僅與外界抗菌藥的使用有關，還與攜帶的耐藥基因有關，耐藥基因可以通過多種途徑在動物和人類之間傳播，不僅導致耐藥性的產生，還對人類健康造成隱患[10-11]。姜夢等[12]研究表明，從昆明某雞場分離的沙門菌攜帶多耐藥基因型。本試驗結果顯示，分離的109株沙門菌攜帶多種耐藥基因，攜帶耐藥基因型是否是引起耐藥性產生的主要因素，有待進一步研究。本試驗為該地區的肉種雞場沙門菌的防控提供了科學依據。