細菌防御噬菌體機制研究進展

趙婷婷 ， 郭子群 ， 高云航，2 ， 徐鳳宇，2 ， 趙傳芳

(1.吉林農業大學動物醫學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室 ， 吉林 長春 130118 ； 3.中國農業科學院特產研究所 ， 吉林 長春 130112)

噬菌體作為地球上數量最豐富的生物，能特異地拮抗宿主菌，在保護人類和動物免受耐藥菌感染等方面具有潛在優勢[1-2]。但體內外抗菌試驗結果表明，噬菌體并不能完全殺滅宿主菌[3-4]，說明細菌具有一定的防御噬菌體的能力。事實上，數十億年來，細菌已進化出復雜的防御體系，其中的限制性內切酶、CRISPR/Cas系統等已應用于生物技術領域。近年來，揭示細菌防御噬菌體機制的進程加快，本文對此進行綜述，希望為其在工農業生產中的應用提供參考。

1 抑制噬菌體吸附

噬菌體吸附于細菌表面的受體是其復制的開始(圖1A)，抑制吸附是細菌防止噬菌體感染最安全的方法。近年來研究發現細菌可通過以下方式抑制噬菌體吸附。

1.1 以外膜泡結合噬菌體 Reyes-Robles等[5]研究顯示，霍亂弧菌分泌的天然誘餌外膜泡(Outer membrane vesicles，OMVs)可結合烈性噬菌體，無脂多糖O1(噬菌體ICP1的受體)的E7946ΔwbeL及O139株霍亂弧菌分泌的OMVs不能抑制ICP1(宿主菌為E7946)感染，而E7946株分泌的OMVs可以(圖1B)；由OMVs介導的對噬菌體ICP2的抑制作用依賴于ICP2的受體OmpU(圖1C)，表明此抑制作用具有OMVs所含噬菌體受體依賴性。

1.2 受體突變和表面修飾阻斷吸附 韓生義[6]篩選到耐噬菌體SP1的QHM株沙門菌，并發現該菌株參與脂多糖(LPS)合成的rfaJ基因發生了G721T突變，使編碼谷氨酸的GAG突變為終止密碼子，影響糖基轉移酶的合成，導致LPS結構不完整，阻斷了噬菌體SP1吸附(圖1D)，并通過構建缺失株QHΔrfaJ證實了該結果。Harvey等[7]提出了利用糖基化掩蔽以IV型菌毛蛋白(T4P)為受體的銅綠假單胞菌噬菌體潛在結合位點的觀點；作者研究發現，O抗原和D-阿拉伯呋喃糖聚合物糖基化可保護銅綠假單胞菌免受某些菌毛特異性噬菌體侵染，改變菌毛蛋白序列可阻止吸附(圖1E)。

圖1 細菌抑制噬菌體吸附的機制示意圖A：噬菌體正常吸附于敏感菌表面受體； B：細菌釋放的外膜泡上的脂多糖結合噬菌體，阻斷噬菌體對菌體表面脂多糖受體吸附；C：細菌釋放的外膜泡上的外膜蛋白結合噬菌體，阻斷噬菌體對菌體表面相應外膜蛋白受體吸附； D：細菌脂多糖受體結構不完整阻斷噬菌體吸附； E：細菌改變菌毛蛋白，阻止噬菌體對菌毛受體吸附

2 切割噬菌體核酸

噬菌體抗性菌利用先天或獲得性防御系統切割噬菌體核酸，其中獲得性防御系統規律成簇間隔短回文重復序列-CRISPR-相關蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins，CRISPR-Cas)是近幾十年中最重要的科學進展之一。這里介紹近幾年報道的先天性防御系統，其發現于75%的原核生物中[8]。

2.1 與限制修飾有關的防御島系統 Ofir等[9]報道，在細菌和古生菌中廣泛的存在防御噬菌體系統-與限制修飾有關的防御島系統 (Defence island system associated with restriction modification，DISARM)，該系統由5個基因組成，包括編碼甲基化酶的基因(drmMII)、解旋酶基因(drmA)、含有磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)的基因(drmC)、含有解旋酶相關結構域(DUF1998)的基因(drmB)和功能未知基因(drmE)；轉移有副水楊芽胞桿菌9945A株DISARM的枯草芽胞桿菌能抵御3株有尾雙鏈DNA噬菌體；其甲基化酶修飾CCWGG基序，作為自身DNA的標記，而限制侵染的噬菌體DNA(封二圖2A)。

2.2 噬菌體排斥系統 2021年，Picton等[10]證明了費格森埃希菌的多重耐藥質粒具有多而強大的防御噬菌體功能：表達Ⅰ型細菌排斥(Bacteriophage exclusion，BREX)防御系統、GmrSD家族的IV型DNA修飾依賴限制酶BrxU；BREX的效應物能識別噬菌體的非甲基化非回文BREX基序GCTAAT，防止噬菌體增殖，BrxU可切割經胞嘧啶修飾的DNAs，PglX使宿主DNA的GCTAAT序列在第5位被甲基化而獲得保護(封二圖2B)。

2.3 SspABCD-SspE及SspABCD-SspFGH硫代磷酸酯限制修飾系統 2020年，Xiong等[11]描述了在環磷弧菌、大腸埃希菌和Streptomycesyokosukanensis中存在的SspABCD-SspE硫代磷酸酯(Phosphorothioates，PTs)系統，它具有獨特的遺傳結構、生化功能和表型；本系統中SspB為切口酶(Nickase)，可引入缺口以促進硫的摻入；系統中的SspABCD與SspE聯合抵抗噬菌體：(1)SspE借助PTs激發的核苷三磷酸水解酶(Nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)活性感知序列特異性PTs發揮抗噬菌體活性；(2)SspE通過引入切口損傷削弱噬菌體DNA復制而抑制噬菌體增殖。2021年，Wang等[12]鑒定了SspABCD-SspFGH防御系統，發現SspFGH可破壞非PTs修飾的DNA，抑制噬菌體DNA復制，雖與SspABCD-SspE不同，但二者共存于36個細菌基因組中，共同保護細菌防御噬菌體(封二圖2C)。

2.4 Ago的DNA干擾作用 細菌和古細菌中的Argonaute核酸酶(Ago)通過小DNA引導切割DNA的過程稱為DNA干擾。Kuzmenko等[13]分析了丁酸梭菌Ago(CbAgo)的體內活性，表明CbAgo靶向多拷貝遺傳元件，抑制質粒傳播和噬菌體感染；CbAgo在同源序列間誘導DNA干擾，觸發目標DNA降解，與位點特異性小DNA向導的加載依賴于其固有的核酸內切酶活性和細胞雙鏈斷裂修復機制；Ago含有氨基端(Amino-terminal，N)、PAZ(PIWI Argonaute Zwille)、MID(Middle)、PIWI(含有RNase-H樣活性位點)結構域及L1、L2連接蛋白(封二圖2D)。

3 抑制噬菌體核酸合成

Yasui等[14]描述了含有abpA和abpB基因質粒的大腸埃希菌可阻止T4、T2、T7和λ家族噬菌體復制，與野生株相比，缺失其一都會導致噬菌體后代增加20%；作者分離到7株T4噬菌體的抑制突變株，它們在過表達abpA和abpB的細菌中繁殖能力微弱，突變均位于編碼對DNA復制起重要作用的DNA解旋酶基因41中；作者還證明abpA和abpB抑制T4噬菌體的DNA復制和晚期基因表達，也能抑制T7和λ噬菌體的DNA復制。

Viperin作為動物的一種干擾素誘導蛋白，可催化RNA聚合酶終止劑3′-脫氧-3′,4′-雙脫氫-三磷酸胞苷(ddhCTP)產生而抑制多種病毒復制。Bernheim等[15]研究表明，與Viperin相似，原核生物的Viperins會促進ddhCTP、雙脫氫-三磷酸鳥苷(ddhGTP)和雙脫氫-三磷酸尿苷(ddhUTP)產生，抑制T7噬菌體轉錄。

4 流產感染

流產感染(Abortive infection，Abi)，即感染噬菌體的細菌在噬菌體復制周期完成前通過“利他性”自殺阻止噬菌體傳播，從而保護周圍的細菌[16]。

4.1 激活宿主菌自體磷酸化致流產感染 Depardieu等[17]發現，葡萄球菌中存在一種激酶介導的Abi機制，噬菌體感染時，其蛋白PacK觸發葡萄球菌的真核生物樣絲氨酸/蘇氨酸激酶Stk2自體磷酸化，導致翻譯、轉錄控制、細胞周期控制和應激反應等過程被抑制，使細菌死亡，防止噬菌體感染其他細菌(封二圖3A)。

4.2 逆轉錄子致流產感染 Millman等[18]報道細菌的逆轉錄子Retrons 通過流產感染發揮廣泛的防御噬菌體作用，此防御單元由三部分組成：逆轉錄酶(Reverse transcriptase，RT)、非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)和效應蛋白；作者證明了Ec48(大腸埃希菌的Retron)可“守護”細菌的RecBCD復合物(降解噬菌體線性DNA及幫助細菌獲得CRISPR的新間隔序列)，噬菌體蛋白抑制RecBCD但激活Ec48，導致感染失敗、細菌停止生長(封二圖3B)，形成了保衛周圍細菌的防線。

4.3 激活環寡核苷酸為基礎的抗噬菌體信號系統致流產感染 一些細菌中存在環寡核苷酸為基礎的抗噬菌體信號(Cyclic oligonucleotide-based anti-phage signaling，CBAS)系統，此系統包括寡核苷酸環化酶(Oligonucleotide cyclase,cGAS)、信號分子、殺傷細菌的效應物和輔助基因。

Cohen等[19]研究表明，細菌的環GMP-AMP(Cyclic GMP-AMP，cGAMP)信號系統可感應噬菌體的感染，產生cGAMP，進而激活磷脂酶(Phospholipase)，導致細胞膜完整性喪失。

Lau等[20]研究表明，細菌CBAS系統的效應物NucC與限制性核酸內切酶(Endonuclease)有關，NucC可獨特地組裝成同源三聚體，此三聚體與環三腺苷酸第二信使結合，促進NucC同源六聚體組裝，從而有助于非特異性雙鏈DNA斷裂；在感染菌中，NucC的激活使細菌染色體完全破壞，導致細菌在噬菌體復制完成前死亡。

Ka等[21]報道，Thoeris防御結構由ThsA和ThsB組成；ThsA具有強大的NAD+降解活性，含有Sirtuin樣和SLOG樣雙結構域；突變分析表明，NAD+降解與Thoeris抗噬菌體有關；ThsB的結構與Toll/IL-1受體(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)結構域相似。2021年，Ofir等[22]研究表明，噬菌體感染觸發TIR結構域產生環ADP-核糖異構體，激活 ThsA，耗盡細胞的NAD+，導致流產感染及細胞死亡。

2021年，Millman等[23]根據操縱子結構、信號分子和效應物對CBAS系統進行分類，確定了4種主要類型；效應物包括磷脂酶、跨膜螺旋(Transmembrane helices)、內切核酸酶、TIR結構域、磷酸化酶/ 核苷酶超家族(Phosphorylase/nucleosidase superfamily)、肽酶(Peptidase)，分別通過降解細胞膜的磷脂、使細胞膜上成孔、降解DNA等方式使細菌自殺(封二圖3C)。

5 干擾噬菌體裝配

噬菌體可誘導染色體島(Phage inducible chromosomal island，PICI)是整合于細菌染色體上的基因簇，可通過限制噬菌體增殖和攜帶重要毒力基因，為宿主菌提供適應優勢[24]。在革蘭陽性菌中，PICI的表達被轉錄抑制物抑制，而輔助噬菌體可產生一種抗阻遏物，導致從宿主染色體上切下PICI，PICI基因簇復制，并表達出可抑制輔助噬菌體晚期基因表達的蛋白，改變噬菌體衣殼大小，使PICI基因簇優先被包裝，防止形成輔助噬菌體病毒子[25]。

霍亂弧菌具有可移動的PICI樣元件 (Phage inducible chromosomal island-like element，PLE)，在噬菌體ICP1感染期間通過從染色體上被切割而啟動宿主抗噬菌體反應，保護霍亂弧菌免受ICP1感染，此過程依賴于PLE編碼的Int[26]。McKitterick等[27]報道PICI樣元件中的PLE1編碼大絲氨酸重組酶，產物Int為重組方向性因子(Recombination directionality factor，RDF)，是針對ICP1的特異蛋白，在噬菌體感染時切下PLE。

6 展望

在細菌與噬菌體的長期軍備競賽中，雙方均獲得相應的動力而共同進化，這其中也包括前噬菌體為保護宿主免受異型病毒攻擊的貢獻[28-29]，使得他們相互拮抗[30]，保持自身種群穩定。噬菌體抗性的進化對噬菌體的應用效果構成了不可避免的威脅，在應用噬菌體療法過程中，需充分了解其使用范圍及作用[1]，考慮噬菌體與藥物或噬菌體等的組合，以避免耐多噬菌體菌株的出現及蔓延。另一方面，對細菌防御噬菌體機制的深入研究可使人們充分了解抗噬菌體菌株特性，利于工農業生產中定向篩選更具優勢的商品化菌株；同時為生物技術領域開發更多的可應用工具；也希望為進一步挖掘真核生物抗病毒的機制提供啟示。