乳桿菌AI-2/LuxS系統介導的生理代謝對環境脅迫的響應及其人工調控

胡瑜，張泓，張惠玲，解寒，陸震鳴，柴麗娟，張曉娟*，史勁松，許正宏

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122) 3(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)4(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心， 江蘇 無錫，214122)5(江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫，214122)

乳酸菌是一種革蘭氏陽性菌，因其安全性和益生效果已被廣泛應用于食品工業，其具有抑制致病微生物生長、預防心血管疾病、調節腸道菌群、降低血糖、增強免疫力、改善消化系統癥狀等多種有益的生理活性功能[1-2]。乳酸菌的抗逆特性在許多生產和應用場景中都具有重要意義，例如耐酸、耐膽鹽的性能是乳酸菌開發成為益生菌的重要性能指標，而在發酵食品，如酸奶、泡菜、發酵高酸的果蔬果汁等產品生產過程中，都對菌種耐酸、耐鹽等抗逆性能提出了要求。

研究發現絕大多數微生物能夠以生物膜形式提高對外界不良環境的抵御能力。微生物分泌到胞外的多糖、核酸等物質使細胞間相互聯結的同時為微生物提供了天然屏障，因此生物膜狀態的菌株相較浮游態菌株具有更強的耐藥、耐熱等性能[3-4]。然而現有研究多集中于對有害微生物生物膜的消除中，關注益生菌生物膜的研究較少。部分研究證實通過形成生物膜，乳酸菌提高了對乙醇、乙酸、膽鹽等的耐受能力[5-6]。生物膜的形成與發展受外界環境和自身調節機制等多種因素影響，其中群體感應(quorum sensing, QS)系統與生物膜形成間的關系被諸多研究者所關注。在對乳酸菌生物膜的研究中發現，luxS基因參與了其生物膜的形成[7]。luxS基因是AI-2/LuxS型QS系統中的關鍵基因，在半胱氨酸代謝途徑中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAM)經甲基轉移酶作用生成S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH)，S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase, Pfs)將SAH水解為S-核糖半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine, SRH)和腺嘌呤，SRH經LuxS蛋白催化生成高半胱胺酸和(S)-4,5-二羥基-2,3-戊二酮 [(S)-4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione, DPD]。DPD經自身分子環化重排后即為信號分子AI-2[8]。AI-2在環境中被微生物感知進而調控下游基因的表達，然而在乳酸菌等大多數微生物中信號分子AI-2調控的下游途徑尚不明確。

綜上，已有研究表明乳酸菌AI-2/LuxS型QS系統與環境脅迫間存在相關性，但是具體的調控機制不明確，調控效果也表現出菌株特異性，因此有待進一步研究闡明。此外，現有研究主要集中于通過抑制AI-2/LuxS系統消除有害微生物，通過正向調控AI-2/LuxS提高菌株生理特性的研究較少。基于此，本研究以檸檬酸馴化前后的2株有直接、緊密親緣關系的植物乳桿菌為研究對象，兩者在AI-2活性、生物膜形成能力、檸檬酸耐受性方面具有顯著差異。研究從生物膜及QS角度入手，對比出發和子代菌株在不同檸檬酸脅迫下生長、代謝產物、信號分子AI-2及相關基因表達的變化情況，以進一步明確AI-2/LuxS系統與菌株抗逆性的關系。并通過外源物質干擾AI-2/LuxS系統，探究能否通過環境干預方式調控AI-2/LuxS系統進而調控菌株生長及代謝情況，以期為通過QS系統調控菌株抗逆性能以及代謝性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌D(LactobacillusplantarumD, LP-D)及檸檬酸馴化后的植物乳桿菌D-840(L.plantarumD-840, LP-D840)，實驗室保藏菌株。坎氏弧菌(ibriocampbellii) BB-170，北京百歐博偉生物技術有限公司。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基參照文獻[9]配制；對于AI-2的生物學檢測，將葡萄糖等量替換為半乳糖[10]。AB培養基參照文獻[11]配制。海水2216E液體培養基，青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器

S220型微量pH計，瑞士METTLER-TOLEDO公司；Synergy H1型酶標儀，美國BioTek公司；CFX Connect型熒光定量PCR系統，Bio-Rad公司；DHZ-DA型恒溫搖床，太倉市實驗設備廠；5425R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SHP-250型恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；U-1000型分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；NanoDrop2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；Waters e2695型高效液相色譜，美國Waters公司。

1.1.4 主要試劑

細菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PowerUpTMSYBRTMGreen預混液、LIE/DEADTMBacLightTMBacterial iability and Counting Kit，美國Thermo Fisher Scientific公司；DPD，英國Carbosynth公司；SAM，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物膜檢測

參考文獻[12]的方法并略作修改，將活化3代后的菌液按2%(體積分數)接種至新鮮MRS培養基中，于96孔板中37 ℃靜置培養24 h后棄去培養基，使用生理鹽水洗滌3～5次后加入200 μL 95%甲醇固定15 min。棄甲醇于室溫干燥片刻，加入5 g/L的結晶紫染色20 min后用生理鹽水清洗至無色。晾干后加入200 μL 95%乙醇脫色30 min。吸取150 μL脫色液至另一96孔板中并測定570 nm下的吸光度值。

1.2.2 乳酸及苯乳酸的測定

將活化3代后的菌液按2%(體積分數)接種至新鮮MRS培養基中，37 ℃靜置培養。發酵液于9 000×g離心10 min后取上清液，使用0.22 μm微孔濾膜過濾。乳酸和苯乳酸的檢測均采用Waters e2965高效液相色譜儀，Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。檢測乳酸的流動相為20 mmol/L NaH2PO4(pH=2.7)，流速0.7 mL/min[13]。檢測苯乳酸的流動相為含有0.05%(體積分數)三氟乙酸的甲醇(A)和含有0.05%(體積分數)三氟乙酸的超純水(B)；梯度洗脫程序：10%～100% A(0～20 min)，100% A(20～23 min)，100%～10% A(23～25 min)，流速1.0 mL/min[14]。

1.2.3 被膜態及浮游態菌株的制備

參照文獻[15]的方法并稍作修改，將活化后的菌株LP-D840按2%(體積分數)接種至MRS培養基中，其中被膜態菌株于37 ℃靜置培養，浮游態菌株于具塞錐形瓶中37 ℃、200 r/min下振蕩培養，將培養24 h后的活化3代菌株打散后于6 000×g離心10 min收集菌體并采用磷酸鹽緩沖液重懸菌體至OD600=1.0。

1.2.4 被膜態及浮游態菌株抗逆性能測定

參照文獻[16]將被膜態和浮游態菌株分別重懸于含有25 g/L檸檬酸、25 g/L蘋果酸、5 g/L膽鹽的MRS培養基中，37 ℃處理2 h。處理后的菌株于6 000×g離心10 min后采用磷酸鹽緩沖液洗滌2次并重懸。使用LIE/DEADTMBacLightTM試劑盒對菌株采用SYTO9/碘化丙啶熒光染料雙染后通過流式細胞儀分析細胞存活率。

1.2.5 無菌上清液制備

將活化24 h后的活化3代菌株按2%(體積分數)接種至半乳糖改良的MRS培養基中，37 ℃靜置培養，于不同培養時間取樣測定其OD600值。另取一份于6000×g離心10 min后取上清液，采用1 mol/L NaOH調節pH至7.0后通過0.22 μm 無菌過濾器過濾，用于后續信號分子AI-2檢測。

1.2.6 生物學法檢測信號分子AI-2

將坎氏弧菌BB-170接種于海水2216E培養基中活化2代后按1%(體積分數)接種至AB培養基中，過夜培養至OD600為0.7～1.2。按體積比1∶5 000將菌液稀釋到新鮮AB培養基中。將樣品、陰性對照、介質對照的無菌上清液與稀釋后的菌液按體積比1∶10混合，30 ℃、180 r/min振蕩孵育。于陰性對照熒光強度最低時測定各樣品的熒光強度，并計算其相對熒光強度以代表信號分子AI-2活性[11]。按公式(1)計算：

(1)

式中：RLU，樣品相對熒光強度；LUsample，樣品熒光強度；LUmedium，介質對照熒光強度。

1.2.7luxS和pfs基因表達量的測定

將活化24 h后的3代菌株按2%(體積分數)接種至不同檸檬酸濃度的MRS培養基中，37 ℃靜置培養，于7 h收集菌體。提取RNA后對RNA進行DNA的去除以及反轉錄。以反轉錄得到的cDNA為模板進行熒光定量PCR，反應體系為20 μL(2 μL cDNA，10 μL SYBR，6 μL ddH2O，上下游引物各1 μL)。qPCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。數據分析采用2-ΔΔCT法[17]。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.3 數據處理與統計分析

所有實驗均進行3次生物學重復，結果用平均值±標準差表示，采用Graphpad Prism 8軟件進行統計學分析并繪圖，2組間數據比較采用獨立樣本T檢驗(unpairedT-test)，3組及以上數據采用單因素方差分析(one-way ANOA)的Tukey法進行兩兩比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示無顯著差異。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸馴化前后菌株生理特性比較

LP-D為實驗室前期研究發現具有較好的發酵性能的菌株，對高酸的原料也具有較強的耐受性。因此前期以LP-D為出發菌株，通過實驗室連續傳代馴化，獲得了一株能夠耐受更高檸檬酸濃度的LP-D840。

出發菌株LP-D和馴化后的LP-D840生理性狀如圖1所示。

a-菌體密度；b-乳酸及苯乳酸產量；c-生物膜形成能力圖1 檸檬酸馴化前后菌株生理代謝性能比較Fig.1 Comparison of physiological and metabolic properties of the original and citric acid acclimated strains

LP-D840在含0 g/L和15 g/L檸檬酸的MRS培養基中的菌體密度均高于LP-D，且在檸檬酸濃度為15 g/L時菌體密度較LP-D提高了5.4倍(圖1-a)。發酵24 h后LP-D840的乳酸及苯乳酸產量均略高于LP-D(圖1-b)。此外觀察到出發菌株LP-D幾乎不形成生物膜，而經檸檬酸馴化后的菌株LP-D840生物膜形成能力提高了485%(P<0.05)。

生物膜的形成可能是微生物在自然界中抵御各種環境脅迫的一種機制[5,16],結合本研究中發現耐酸性和生物膜形成2種表型在馴化后的菌株LP-D840中同時出現，分析認為LP-D840檸檬酸耐受性的提高可能與其生物膜形成相關。

2.2 被膜態與浮游態菌株抗逆性能對比

為了分析LP-D840顯著提高的生物膜合成能力是否與其更高的抗逆性能有關，本研究對比了LP-D840在被膜態和浮游態2種狀態下對逆性條件的耐受程度。由圖2可知，被膜態菌株在25 g/L檸檬酸、25 g/L蘋果酸以及5 g/L膽鹽脅迫下的存活率均顯著高于浮游態菌株(P<0.05)。

a-流式細胞存活率圖；b-存活率柱狀圖圖2 不同脅迫下LP-D840被膜態與浮游態的存活率Fig.2 Surial rates of biofilm and planktonic cells of LP-D840 under different stress

此結果表明馴化子代LP-D840所具有的更強耐受性能與其生物膜的形成密切相關。劉蕾等[16]研究發現被膜態類植物乳桿菌(L.paraplantarum)L-ZS9相較浮游態具有更好的耐熱、耐酸、耐膽鹽能力，本文結論與之一致。

2.3 發酵過程中QS信號分子AI-2變化

諸多研究表明生物膜的形成與QS系統具有一定的相關性[6,18]，對發酵過程中LP-D和LP-D840產信號分子AI-2及其菌體生長情況定量分析，采用Logistic模型擬合生長曲線。如圖3所示，LP-D840和LP-D大致在4 h左右進入對數生長期。2株菌的AI-2在4～8 h間迅速積累，LP-D所產AI-2在16 h達到最高后略有下降，而LP-D840所產AI-2在8 h達到最高后略有下降，這一峰值出現時間遠早于菌體濃度最大值出現時間(20～24 h)。隨發酵進行2株菌的單位菌體AI-2信號合成能力呈下降趨勢，發酵后期菌體濃度達到一定值后(12 h)，單位菌體AI-2的合成量維持在較低的水平直至發酵結束。

a-LP-D；b-LP-D840圖3 發酵過程中菌體密度與AI-2活性的變化Fig.3 The changes of cell growth and AI-2 actiity during fermentation

在本研究中，發酵初期細胞上調AI-2/LuxS系統的表達以維持一定環境濃度的AI-2信號，進而發揮細胞交流的作用，且LP-D840能更早地達到較高的AI-2信號分子的積累濃度。因此分析認為AI-2信號的分泌可能是促進菌體生長的一種調控機制。然而MAN等[19]發現植物乳桿菌KLDS1.0391的信號分子AI-2在指數生長后期達到最高值，隨后在穩定期迅速下降。有研究認為AI-2可能作為一種代謝產物被菌株自身消耗，從而導致發酵后期AI-2的下降[20]，但這一結論還有待進一步探究。

2.4 馴化前后菌株AI-2的QS系統對檸檬酸脅迫響應程度存在差異

2株菌的菌體密度隨檸檬酸濃度升高均呈下降趨勢(圖4-a)，但上清液中AI-2活性總體呈上升趨勢(圖4-b)，且在相同檸檬酸濃度下LP-D840上清液中AI-2活性高于LP-D。但LP-D840單位菌體密度下的AI-2強度卻顯著(P<0.05)低于出發菌株(圖4-c)。

a-菌體密度；b-上清液AI-2活性；c-單位菌體密度下AI-2活性圖4 檸檬酸脅迫對LP-D和LP-D840生長及AI-2活性影響Fig.4 Effects of citric acid stress on growth and AI-2 actiity of LP-D and LP-D840 注：圖中不同小寫字母表示LP-D組在P<0.05水平存在顯著差異；圖中不同大寫字母表示LP-D840組在P<0.05水平存在顯著差異(下同)

本研究中兩株菌合成更多的AI-2信號分子響應檸檬酸脅迫，并且這種響應強度和檸檬酸脅迫壓力呈正相關。經檸檬酸馴化后的LP-D840，在脅迫下單位菌體AI-2合成能力下降，這可能與該菌株檸檬酸耐受性能提高相關。這與MOSLEHI-JENABIAN等[11]發現經酸適應后的鼠李糖乳桿菌在遭遇酸脅迫時luxS基因表達顯著低于野生型菌株相似。

信號分子AI-2合成通路如圖5-a所示。對參與AI-2合成的luxS和pfs基因測序發現馴化后的LP-D840較LP-D并未產生非同義突變。RT-qPCR結果如圖5-b和圖5-c所示，檸檬酸脅迫下2株菌的luxS基因表達下調，而pfs基因表達上調。在15 g/L檸檬酸濃度下，LP-D和LP-D840中的luxS基因表達量分別降低了34.5%、28.8%(P<0.05)，而pfs基因表達量分別提高了71.4%、49.3%(P<0.05)。

a-信號分子AI-2合成通路；b-LP-D；c-LP-D840圖5 檸檬酸脅迫下LP-D和LP-D840中luxS、pfs基因轉錄水平Fig.5 Transcription leel of luxS and pfs genes of LP-D and LP-D840 after exposure to citric acid stress

luxS基因表達量與AI-2產量呈現負相關，這與WANG等[21]對luxS基因的過表達并未提升AI-2產量的結果一致。而pfs基因在檸檬酸脅迫下的表達量與AI-2呈現正相關性，說明在本研究體系中與luxS基因相比，pfs基因對AI-2的合成起更顯著的調控作用，并且與菌株檸檬酸耐受能力相關性更強。

2.5 外源添加信號分子前體對菌株生理特性的調控

YANG等[22]研究表明苯乳酸的合成可能受AI-2/LuxS系統調控，因此研究了外源添加信號分子前體對菌株生長、乳酸和苯乳酸合成的影響。圖6所示，不同濃度的DPD對馴化前后兩株菌生長曲線無顯著影響，但能夠影響馴化后LP-D840的乳酸和苯乳酸產量。DPD添加量大于0.5 μmol/L時開始顯著抑制LP-D840乳酸的合成。0.1 μmol/L的DPD促使LP-D840苯乳酸產量顯著提高27.1%。

a-LP-D菌體密度；b-LP-D840菌體密度；c-乳酸產量；d-苯乳酸產量圖6 外源添加DPD對LP-D和LP-D840生理代謝的影響Fig.6 Effects of exogenous DPD on cell growth and metabolism of LP-D and LP-D840

上游物質SAM能夠抑制LP-D及LP-D840菌體生長。如圖7所示，在SAM添加量為1 g/L時，LP-D和LP-D840的菌體密度分別顯著降低了12.8%和7.1%。在SAM的干擾下乳酸的產量變化幅度較小，苯乳酸產量總體呈現上升趨勢，在SAM添加量為1 g/L時，LP-D和LP-D840苯乳酸產量分別顯著提高了12.2%和25.5%。

a-菌體密度；b-乳酸產量；c-苯乳酸產量圖7 外源添加SAM對LP-D和LP-D840生理代謝影響Fig.7 Effects of exogenous SAM on cell growth and metabolism of LP-D and LP-D840

DPD的添加對菌株生長曲線并無影響，這可能因為luxS基因與菌株生長不相關，這與JIA等[23]對植物乳桿菌luxS基因敲除的實驗結果相符。由于菌株之間存在AI-2代謝途徑速率的差異，導致其對不同前體的響應幅度存在差異。外源添加AI-2前體物質能夠干擾菌株QS系統，進而提高代謝產物苯乳酸的積累，這一方法相較于基因工程改造菌株以及馴化育種在安全性和時間周期上有一定的優勢。

3 結論

本研究證實了生物膜的形成能夠顯著提升菌株的抗逆性能(P<0.05)，明確了AI-2/LuxS系統參與了菌株對檸檬酸脅迫的抵御。結合基因轉錄及外源添加DPD、SAM結果，本研究的兩株植物乳桿菌參與AI-2合成的上游pfs基因、SAM對菌株生理代謝的調控，其作用效果優于luxS基因和DPD，因此pfs基因可能是調節AI-2的關鍵靶點。本文的結果拓展了AI-2/LuxS QS系統對環境脅迫響應的研究，并為人工調控AI-2/LuxS QS系統，進而改善菌株發酵性能提供了新的方向和研究依據。