ccpN敲除對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽合成代謝的調控效應

黃雪松，丁躍，宋昭，陳曉斌，陳雄，王志*

1(發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業發酵協同創新中心，湖北省工業微生物重點實驗室， 湖北工業大學，湖北 武漢，430068)2(綠康生化股份有限公司，福建 浦城，353400)

桿菌肽是由地衣芽胞桿菌等菌株通過非核糖體合成酶系合成的環肽分子[1]，包含Orn、His、Cys、Leu等11種氨基酸[2]，桿菌肽能抑制細菌細胞壁的合成，對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有抑制作用[3]。其在動物腸道內穩定性好、安全性高、吸收率低等優點，因而廣泛用于動物疾病的防治[4]。

桿菌肽合成需要提供能量和前體氨基酸，劉鐵軍等[5]發現地衣芽胞桿菌細胞對數生長時消耗大量的葡萄糖，從而產生分解代謝產物阻遏(carbon catabolite repression, CCR)效應[6]，抑制桿菌肽的合成，維持初級代謝強度可以滿足產物合成期對能量和前體氨基酸的需求。分解代謝物調控蛋白CcpA是枯草芽胞桿菌中介導CCR效應的全局調控因子，CcpA蛋白與輔助蛋白HPr/Crh-Ser46-P形成復合物，作用于靶基因的分解代謝物響應元件，抑制或激活靶基因的轉錄[7]。張清等[8]在地衣芽胞桿菌基因cydB(編碼細胞色素bd泛醇氧化酶)缺失的基礎上整合表達qoxA(編碼細胞色素aa3氧化酶)和dck(編碼腺苷激酶DcK)，使菌體胞內ATP濃度提高了49.32%，桿菌肽效價提高21.66%。李陽等[9]敲除地衣芽胞桿菌yhdG基因(編碼氨基酸轉運蛋白YhdG)，顯著提高了胞內氨基酸含量，且與原始菌株相比桿菌肽效價提高了11%。

枯草芽胞桿菌的CcpN蛋白調控糖異生途徑的運轉效率，其對數期阻遏gapB(編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶)和pckA(編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，消耗GTP)的表達[10]。敲除ccpN后細胞對數期會在草酰乙酸-磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸之間產生耗能循環，菌體糖耗和生長速率降低。但是地衣芽胞桿菌敲除ccpN對細胞生長、桿菌肽合成代謝(包括溢流代謝、氨基酸代謝與轉運、能量代謝等)的調控細節尚有待進一步闡明。

地衣芽胞桿菌DW2生長、桿菌肽合成代謝在能量及前體利用方面存在競爭關系，為了提高對數期桿菌肽的合成效率，在20 L發酵罐水平研究了地衣芽胞桿菌DW2和DW2ΔccpN發酵期間細胞生長速率、糖耗速率、胞外氨基酸濃度以及溢流代謝[11]和桿菌肽合成代謝差異，并基于轉錄組數據，分析了對數期與能量代謝、氨基酸轉運以及丙酮酸轉化相關的13個基因轉錄組表達的差異，為地衣芽胞桿菌DW2發酵生產桿菌肽提供有效的思路和策略。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養基

地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)DW2，地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)DW2ΔccpN，湖北大學綠康生物工程研究所。

平板、茄子瓶斜面培養基(g/L)：酵母浸膏20，NaCl 5，瓊脂20，調pH 7.5。

發酵培養基(g/L)：豆粕85，玉米淀粉40，玉米漿10，輕質CaCO36，蛋白胨20，(NH4)2SO41.0，MgSO4·7H2O 1.0。

1.2 主要試劑與儀器

細胞總RNA提取試劑盒(帶gDNA清除柱)，成都福際生物技術有限公司；高靈敏性染料法定量PCR檢測試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa公司；H2O2含量檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；玉米淀粉、豆粕粉、玉米漿，福建浦城綠康生化有限公司；其他試劑均為分析純，國藥化學試劑有限公司。

20 L發酵罐，上海保興生物設備有限公司；Thermal Cycler PCR儀、Uniersal Hood 凝膠成像系統、熒光定量PCR儀，Bio-Rad(美國)；U3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；7890B氣相色譜儀(配氫火焰離子化FID檢測器)， 美國Agilent公司。

1.3 培養方法

1.3.1 平板種子活化

取-80 ℃甘油管中的菌液200 μL于平板均勻涂布，37 ℃培養24 h。

1.3.2 茄子瓶種子培養

用無菌接種環刮取培養后平板菌苔，均勻涂抹至茄子瓶斜面后，37 ℃培養24 h。準備好無菌竹簽和60 mL無菌水，用竹簽和無菌水刮洗長滿菌苔的茄子瓶斜面，得到種子液。

1.3.3 20 L發酵罐培養

20 L發酵罐裝液量為12 L，接種量為一個茄子瓶斜面刮洗的菌懸液60 mL。發酵條件：初始通風量1.2 m3/h，轉速500 r/min，發酵24 h后調至1.6 m3/h，轉速900 r/min，培養溫度37 ℃。由于分批發酵中，22 h的細胞數是峰值細胞數的1/3左右；桿菌肽效價為峰值效價的1/10左右，因而22 h后細胞仍然處于對數生長前期、桿菌肽合成的主合成期也在22 h之后(資料未顯示)，22 h開始取樣可以反映出細胞生長代謝過程的特征信息，因而以發酵22 h作為周期取樣分析的起點。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定

發酵液中細胞數(CFU/mL)采用稀釋涂布平板法測定。

1.4.2 葡萄糖的測定

參考文獻[12]，用DNS法測定葡萄糖的含量。

1.4.3 桿菌肽效價測定

參考文獻[13],采用高效液相色譜儀進行桿菌肽效價測定。

1.4.4 有機酸的測定

參考文獻[13],采用氣相色譜儀，氫火焰離子化FID檢測器，進行揮發性有機酸含量測定。

1.4.5 胞外氨基酸的測定

參考文獻[14],采用茚三酮法測定胞外氨基酸。

1.4.6 轉錄組樣品制備與數據分析

選定對數生長中期作為取樣點，分別對DW2和DW2ΔccpN菌株于20 L發酵罐培養至對數中期，取20 mL發酵液至50 mL離心管中，4 ℃、1 500 r/min離心5 min后初步除去濁液培養基里的不溶物質(花生餅粉、豆粕等)，4 ℃、2 500 r/min離心5 min再次離去不溶性雜質。取上層液體4 ℃、12 000 r/min離心2 min。此時EP管內分3層，上層清液棄置，中層雜質用200 μL槍頭吸取4 ℃無菌生理鹽水輕柔吹打后棄置，留最下層菌體沉淀。菌體保存于-80 ℃冰箱中待轉錄組測定。轉錄組測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。轉錄表達定量分析指標TPM(transcripts per million reads)按照公式(1)計算：

(1)

式中：R和l，需計算基因的read counts和基因長度，Ri和li(i=1,2…,n), 樣品中第i個基因的read counts和基因長度。

1.5 統計分析

試驗數據為3個平行試驗的平均值，用平均值±標準差表示。采用Origin 9.0和SPSS 23.0進行數據處理和分析。其中*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 地衣芽胞桿菌DW2發酵過程參數變化

如圖1-a所示，桿菌肽效價在發酵22～36 h一直處于上升狀態，22 h的起步效價為108 U/mL，一直合成至36 h效價到達峰值1 024 U/mL，平均桿菌肽合成效率為65.43 U/(mL·h)。菌體對數生長至30 h時，菌體量到達高點5.56×1010CFU/mL，30 h后菌體自溶。發酵過程中22 h的殘糖量為7.42 g/L，22～36 h葡萄糖基本耗完，36 h的殘糖量為3.27 g/L，平均糖耗速率為0.3 g/(L·h)。胞外氨基酸含量由22 h的43.8 mmol/L逐漸上升為36 h的131.5 mmol/L，說明發酵過程中豆粕分解較充分。

芽胞桿菌高糖濃度生長會發生溢流代謝[15]，圖1-a中，發酵至22 h時基料的碳源已消耗83%，而且22 h后乙酸等溢流分子處于被利用狀態，說明此時細胞的CCR效應已消除，原受CcpA-Hpr-Ser復合物阻遏的基因脫阻遏表達，包括乙酸在內的溢流分子被利用，這與SCHUMACHER等[7]的報道一致。

a-生物量、桿菌肽效價、葡萄糖、氨基酸；b-有機酸圖1 地衣芽胞桿菌DW2發酵過程中效價、葡萄糖、 氨基酸、生物量和有機酸含量Fig.1 Changes in bacitracin titers, glucose, amino acids, biomass and organic acids content during fermentation of Bacillus licheniformis DW2

碳源濃度高時芽胞桿菌的碳代謝會引起蛋白酶表達系統的阻遏[16]，隨著發酵的進行碳源逐漸被消耗，蛋白酶的表達活性逐漸增強，因此氨基酸的含量上升(圖1-a)。另外，22 h及之后溢流分子處于被利用狀態，此時CCR效應消失而細胞仍處于對數生長狀態(圖1-a)，說明細胞可能啟動了糖異生過程并通過磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶消耗GTP[10]，而GTP濃度降低亦會降低CodY的阻遏活性，使蛋白酶基因和氨基酸轉運基因脫阻遏表達[17]，這也會導致氨基酸濃度上升。

如圖1-b所示，乙酸、異戊酸和異丁酸在發酵22 h的質量濃度分別為2.69、0.9、1.3 g/L，之后處于被利用狀態。而乙偶姻在27 h積累到1.45 g/L，隨后被消耗。其中乙偶姻、異戊酸和異丁酸都在30 h耗完。乙酸質量濃度在30 h后一直低位維持在0.7 g/L。

2.2 地衣芽胞桿菌DW2ΔccpN發酵過程參數變化

如圖2-a所示，桿菌肽22 h的起步效價為276.6 U/mL，至36 h效價到達峰值1 337 U/mL，比DW2峰值效價提高了30.6%，平均桿菌肽合成效率為75.74 U/(mL·h)。菌體對數生長至30 h到達高點(生物量3.39×1010CFU/mL),但只有DW2的61%，這和TNNLER等[10]發現菌體生長速率減半的現象吻合，30 h后菌體依然會自溶，但30～33 h效價合成效率最高。22 h的殘糖量為9.3 g/L，比DW2發酵22 h時多出25.3%。菌株DW2ΔccpN胞外氨基酸含量由22 h的63 mmol/L逐漸上升至36 h的158.3 mmol/L，發酵周期內胞外氨基酸含量比DW2提高20.38%～43.8%。這與CAI等[18]發現敲除ccpN能提高ATP和NADPH的供應從而使氨基酸的供應量增加的報道一致。

菌株DW2ΔccpN溢流代謝產酸變化趨勢如圖2-b所示。乙酸、異戊酸和異丁酸在22 h的濃度分別為2.4、1.33、2.43 g/L，乙偶姻在27 h積累到2.88 g/L。隨后，乙偶姻、異戊酸和異丁酸在33 h耗完，乙酸在22～33 h被消耗，33 h后乙酸濃度一直低位維持在0.64 g/L。由于CcpA的調控效應，兩菌株都會產生溢流代謝[19]，但菌株DW2ΔccpN溢流有機酸總量(22～27 h)比對照DW2高24.7%～37.6%，說明菌株DW2ΔccpN在培養條件下，CcpA的調控活性遠高于DW2，這可能與ccpN敲除后對數期細胞存在的草酰乙酸-磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸耗能循環[10]有關。

a-生物量、桿菌肽效價、葡萄糖、氨基酸；b-有機酸含量圖2 地衣芽胞桿菌DW2ΔccpN發酵過程中效價、 葡萄糖、氨基酸、生物量和有機酸含量Fig.2 Changes in bacitracin titers, glucose, amino acids, biomass and organic acids content during fermentation of B.licheniformis DW2ΔccpN

2.3 能量代謝相關基因轉錄組表達差異分析

敲除ccpN有效降低了菌體生長，并提高了桿菌肽產量(圖2-a)。桿菌肽合成以及前體氨基酸活化均需要消耗ATP，因而，能量供應對其影響很大。劉釗遠[20]在地衣芽胞桿菌中過表達基因icd(編碼異檸檬酸脫氫酶)，顯著提升了ATP、NADPH和氨基酸的供應，進而提高了桿菌肽產量。在細胞對數生長中期比較了DW2和DW2ΔccpN能量代謝相關基因(citZ、icd、zwf、cydA)的轉錄表達量差異，如圖3所示。

圖3 能量代謝相關基因轉錄組表達差異Fig.3 Differences in transcriptome expression of genes related to energy metabolism

citZ參與編碼檸檬酸合酶，催化草酰乙酸和乙酰輔酶A縮合生成檸檬酸，是三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環的關鍵限速酶之一；icd參與編碼異檸檬酸脫氫酶，也是TCA循環的限速酶之一。DW2ΔccpN中citZ和icd的轉錄表達量分別是DW2的3.7倍和10.1倍，說明敲除ccpN能增加TCA循環通量，從而提高桿菌肽產量。zwf編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑關鍵酶，可催化生成5-磷酸核糖和NADPH等，為細胞生長提供重要碳骨架和還原力。ZHU等[21]通過過表達zwf增強了NADPH供應，提高了桿菌肽的產量。DW2ΔccpN中zwf轉錄表達量是DW2的3.6倍，說明敲除ccpN能供應更多的NADPH促進桿菌肽的合成。cydA參與編碼電子傳遞鏈中細胞色素a氧化酶，DW2ΔccpN菌株中cydA的轉錄表達量是DW2的8.3倍，表明敲除ccpN使菌體有氧呼吸能力更強，可供應更多的ATP。

2.4 氨基酸轉運蛋白相關基因轉錄組表達差異分析

氨基酸利用效率是桿菌肽合成的重要因素之一，桿菌肽合成代謝既需要碳源和有氧呼吸供應能量，又需要氮源分解的氨基酸為其合成供應前體[22]。增強前體的供應是常用的策略之一，ZHU等[23]通過強化表達支鏈氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)轉運蛋白brnQ能促進了BCAA的胞內積累和桿菌肽合成。由于22 h后發酵液中氨基酸才出現大量積累的現象，而且DW2ΔccpN菌株桿菌肽合成效率遠高于DW2菌株(圖1、圖2)，這可能與前期氨基酸不足或氨基酸轉運效率低有關。因而對相關基因(codY、relA、brnQ、pr、ybW)的轉錄表達差異進行了對比，如圖4所示。

圖4 氨基酸轉運相關基因轉錄組表達差異Fig.4 Differences in transcriptome expression of genes related to amino acidstransport

CodY是芽胞桿菌氮代謝調控因子，活性CodY能阻遏BCAA合成基因的表達[18]。其調控機制是通過感知胞內GTP和BCAA濃度變化做出響應，當胞內GTP和BCAA含量較低時，CodY作為DNA結合蛋白便會失去活性[24]。如圖4所示，DW2ΔccpN中codY、brnQ(編碼BCAA轉運蛋白)、pr(編碼絲氨酸蛋白酶)和ybW(編碼通用氨基酸轉運酶)的轉錄表達量分別是DW2的9.9、4.9、8.2和11.2倍。說明敲除ccpN提高了菌體氮源分解及氨基酸轉運的能力，充分滿足了桿菌肽合成過程前體氨基酸的供應，對于提升桿菌肽效價起到了重要的作用。這也與菌株DW2ΔccpN胞外氨基酸(22～36 h)濃度比DW2提高20.4%～43.8%的結果相一致(圖1、圖2)。

但是DW2ΔccpN菌株在codY高表達的情況下，氨基酸轉運基因(brnQ和ybW)仍然顯著高表達，說明CodY對brnQ和ybW表達的阻遏活性較低。這與relA高水平表達(比DW2提高2.0倍，圖4)有關。因為relA編碼的RelA蛋白消耗GTP生成鳥苷四磷酸[25]，進而降低CodY的調控活性、干擾RNA的正確加工、降低生長速率、引發細胞的嚴謹響應。這與DW2ΔccpN對數生長細胞數只有DW2的61%是一致的。

2.5 丙酮酸轉化途徑相關基因和hprK轉錄組表達差異分析

圖5 丙酮酸轉化途徑相關基因轉錄組表達差異Fig.5 Differences in transcriptome expression of genes related to the pyruate conersion pathway

pycA參與編碼丙酮酸羧化酶，消耗ATP催化丙酮酸為草酰乙酸。DW2ΔccpN中pycA轉錄表達量是DW2的12.0倍，說明ccpN敲除后丙酮酸轉化能力更強，這與TNNLER等[10]ccpN敲除菌株的報道一致。pckA參與編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，消耗ATP/GTP催化草酰乙酸轉化為糖酵解途徑(Embden Meyerhof pathway,EMP)磷酸烯醇式丙酮酸。DW2ΔccpN中pckA的轉錄表達量是DW2的3.4倍。CcpN在對數期阻遏pckA表達，ccpN敲除后pckA表達在對數期即脫阻遏而表達。pyk編碼丙酮酸激酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸，DW2ΔccpN中pyk的轉錄表達量是DW2的18.4倍。

如圖5所示，pycA、pckA、pyk基因在DW2ΔccpN中轉錄水平都比DW2高3.4～18.4倍。因而，對數期形成了草酰乙酸-磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸耗能循環，并影響了菌體生長效率，這可能是DW2ΔccpN菌株生物量只有DW2菌株61%的原因。

另外，耗能循環會導致EMP途徑1,6-二磷酸果糖上升[10]，從而促進hprK的表達和HPrK的激酶活性、提高CcpA-(Hpr-46-Ser-P)復合體形成效率[7]，從而促發CCR效應。這也是DW2ΔccpN菌株溢流代謝有機酸總量高于DW2菌株24.7%～37.6%的原因(圖1、圖2)，菌株DW2ΔccpN中hprK的轉錄表達量是DW2的12.3倍支持了這一結果。

3 結論

在20 L發酵罐研究了ccpN敲除對地衣芽胞桿菌DW2細胞生長和桿菌肽合成代謝的影響，結果表明，菌株DW2ΔccpN峰值生物量僅為DW2菌株(5.56×1010CFU/mL)的61%；胞外氨基酸(22～36 h)和溢流有機酸(22～27 h)比DW2分別提高20.4%～43.8%和24.7%～37.6%；菌株DW2ΔccpN在36 h時的峰值桿菌肽效價(1 337 U/mL)比DW2提高了30.6%。另外，敲除ccpN后，細胞對數生長期桿菌肽合成代謝相關基因轉錄組數據差異顯著：citZ、icd、zwf、cydA轉錄表達分別上調3.7、10.1、3.6、8.3倍；codY、relA、brnQ、pr、ybW轉錄表達分別上調9.9、2.0、4.9、8.2和11.2倍；pycA、pckA、pyk、hprK轉錄表達分別上調12.0、3.4、18.4、12.3倍。同時ccpN敲除使地衣芽胞桿菌DW2對數期糖耗降低、溢流代謝增強，為對數后期提供了更多的碳源和能源分子。ccpN敲除使細胞嚴謹響應增強、CodY的調控活性下降，降低了細胞的生長速率、提高了氨基酸轉運能力。同時增加了ATP和NADPH的供應，最終提高了桿菌肽的合成效率。