基于全基因組測序平均核苷酸一致性的生胞梭菌(Clostridium sporogenes)鑒定

曹艷花，馮會粉，程坤，劉波，都海渤，謝九艷，辛迪，姚粟

(中國食品發酵工業研究院有限公司 中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

生胞梭菌(Clostridiumsporogenes)源于1908年METCHNIKOFF提出的Bacillussporogenes[1]，由BERGEY等[2]于1923年正式命名為Clostridiumsporogenes，收錄于1980年細菌名稱的批準名錄(approed lists 1980)中[3]。生胞梭菌(C.sporogenes)種名sporogenes(sporos-genes)即spore-producing，譯為產芽胞，故又名產芽胞梭狀芽胞桿菌、產胞梭菌。

生胞梭菌在食品、醫藥等行業應用廣泛。生胞梭菌可在食品行業檢測中作為對照菌株。生胞梭菌是生物危害程度4類的菌種，在通常情況下不會引起人類或者動物疾病，其從表型和基因型方面都與肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)親緣關系最近，可用做肉毒梭菌(C.botulinum)檢測試驗中培養基驗證、方法學驗證和樣品增菌階段的陽性對照菌株[4]。生胞梭菌在醫藥等行業可作為藥品控制菌在微生物污染定性檢測中起重要作用[5]。我國藥典控制菌檢查類群包括生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)等[6]，用于無菌檢查法通過微生物培養檢查藥品是否無菌，其他如歐洲藥典、美國藥典、日本藥局方也有用到生胞梭菌[7]。我國2020版藥典《1101 無菌檢查法》和《1106 非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法》中繼續使用生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)[8]。生胞梭菌亦可用作生物指示劑，如驗證一個滅菌工藝系統能否使產品滅菌后達到無菌要求，可采用生胞梭菌進行相應的物理性驗證及生物指示劑驗證[9-10]。我國2020版藥典《1421 滅菌法》微生物挑戰試驗中根據滅菌工藝選擇適宜的生物指示劑，對于熱不穩定性物品滅菌常用的生物指示劑為生胞梭菌。生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)應用廣泛，對其進行全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)及鑒定具有重要意義。

本研究針對梭菌屬中的生胞梭菌，以中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)保藏菌株CICC 10385(=CMCC 64941)為研究對象，進行基于WGS的平均核苷酸一致性(aerage nucleotide identity，ANI)種水平鑒定，為明確菌種分類學地位、確保使用安全等方面提供依據，同時為研究其生物學功能奠定基礎，為梭菌屬(Clostridiumsp.)相關菌種的鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

實驗菌株CICC 10385為CICC保藏菌株，CICC 10385菌株等同編號為CMCC 64941。

1.1.2 試劑

卵黃瓊脂培養基，北京陸橋技術有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司；2×PCR Mix、DNA Marker，北京全式金生物技術有限公司；API 20 A檢驗試劑條、ITEK ANC鑒定卡，法國梅里埃公司；其他化學試劑均為進口分析純產品。

1.2 儀器與設備

AC2-4S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；5415D離心機，德國Eppendorf公司；professional TRIO 48型PCR儀，德國Biometra公司；BioDrop μLite微量核酸蛋白分析儀，英國Biochrom公司；Gel Doc EZ凝膠成像分析儀，美國Bio-Rad公司；BGISEQ-500全基因組測序儀，深圳華大智造科技有限公司(MGI Tech Co.Ltd.)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株轉接、活化與保藏

采用平板涂布法對凍干管菌種CICC 10385進行轉接活化。在生物安全柜中使用無菌槍頭吸取無菌水置于凍干管中混勻，涂布卵黃瓊脂培養基平板，置于加裝厭氧袋的厭氧罐后密封，35 ℃培養48 h。待單菌落出現后，劃線法轉接至卵黃瓊脂培養基斜面培養，置于4 ℃冰箱保藏。同時將活化的菌株以甘油管形式保藏于CICC備用。

1.3.2 形態學觀察

將CICC 10385接種于卵黃瓊脂培養基平板，置于加裝厭氧袋的厭氧罐后密封，35 ℃培養48 h，觀察其在卵黃瓊脂培養基上的宏觀形態特征，并利用光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察菌體微觀形態特征[11]。

1.3.3 生理生化特征檢測

采用API 20A檢測試劑條及ITEK 2 Compact鑒定系統中的ITEK ANC鑒定卡，依據其說明書中操作步驟對CICC 10385的酶活性、碳源利用等生理生化特征進行檢測。

1.3.4 WGS和ANI分析

1.3.4.1 WGS和組裝

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取CICC 10385基因組DNA，并采用微量核酸蛋白分析儀檢測基因組DNA質量和濃度，確保符合文庫構建要求。檢測合格的基因組DNA進行測序文庫構建與上機測序。獲得測序數據后，對序列數據進行預處理，過濾掉外源序列以及質量較低的序列信息，獲得較高質量的序列信息，將質控后的數據使用SPAdes 3.11.0軟件進行拼接組裝獲得基因組序列及基因組序列總長度、contigs數量、(G+C) mol%含量等參數值。

1.3.4.2 16S rRNA基因預測及序列系統發育分析

使用RNAmmer 1.2軟件進行全基因組中16S rRNA基因預測，獲得序列通過模式菌株序列數據庫進行序列比對，獲得同近緣種序列相似性[12-14]。采用MEGA 5.0軟件中的p-distance模型計算進化距離，鄰接法(neighbor-joining)構建16S rRNA基因序列系統發育樹[15]，自展值(bootstrap alues)設為1 000分析評估進化樹的穩定性，進行菌株CICC 10385的16S rRNA基因序列系統發育分析。

1.3.4.3 ANI分析

進行CICC 10385全基因組ANI分析[16]，將16S rRNA基因序列相似性>98.65%的模式菌株作為ANI分析比對參考模式菌株，從NCBI數據庫下載參考模式菌株全基因組序列。利用ANI Calculator(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)進行CICC 10385全基因組序列和參考模式菌株序列比對，若實驗菌株僅與1個參考模式菌株序列ANI值大于95%～96%[17-18]，則判定實驗菌株與此參考模式菌株為同1個種。通過核心基因系統發育分析(core-genome multi-locus sequence typing，cgMLST)，獲得CICC 10385與近緣模式菌株全基因組序列的共有基因，采用TreeBeST 1.9.2中PHYML基于最大似然法(maximum likelihood)構建系統發育樹，自展值設為100。采用Genome-to-Genome Distance Calculator(GGDC 3.0，http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php)計算CICC 10385與近緣模式菌株的DNA-DNA雜交(DNA-DNA hybridization，DDH)值，70%可作為原核生物種水平判定閾值[19]。

2 結果與分析

2.1 菌株CICC 10385的轉接活化與形態學觀察

經過凍干管打管轉接活化實驗菌株CICC 10385，在卵黃瓊脂培養基上35 ℃厭氧培養48 h，菌落直徑為3～6 mm，菌落白色、近圓形、扁平、邊緣不規則，菌落珍珠層樣，周圍窄虹彩樣薄層(圖1-a)；光學顯微鏡觀察顯示菌體直桿狀或稍彎曲，(0.5～0.6) μm×(1.1～4.1) μm，單個或成對排列，芽胞橢圓形，近端生，胞囊膨大，革蘭氏陽性(圖1-b)。電子顯微鏡菌體形態見圖1-c。結果顯示CICC 10385的形態特征符合伯杰氏系統細菌學手冊中對生胞梭菌的基本特征描述[11]。

a-宏觀形態學觀察；b-光學顯微鏡觀察；c-掃描電鏡觀察圖1 CICC 10385的形態學觀察結果Fig.1 Morphological obseration result of CICC 10385

2.2 菌株CICC 10385生理生化特征

經API 20A檢測試劑條和ITEK 2 Compact鑒定系統中的ITEK ANC鑒定卡對菌株CICC 10385的酶活性、利用碳源產酸等生理生化特征進行檢測。API 20A檢測試劑條鑒定系列有21個測定指標，能快速、簡便地對厭氧菌進行生化鑒定。API 20A檢測結果顯示，菌株CICC 10385能水解明膠與七葉靈，能利用麥芽糖和海藻糖產酸，不能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、柳醇、木糖、阿拉伯糖、甘油、纖維二糖、甘露糖、松叁糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖等產酸。采用API 20A鑒定檢測與生胞梭菌和肉毒梭菌相似率均為99.9%。補充實驗顯示具有牛奶不凝固、蛋白胨-酵母膏-葡萄糖+膽堿培養基不生長、淀粉不水解等特征。API 20A檢測結果詳見表1。

表1 CICC 10385的API 20A檢測結果Table 1 API 20A test result of CICC 10385

ITEK 2 Compact鑒定系統中的ITEK ANC厭氧菌鑒定卡基于已建立的生化方法并采用新開發的底物，共有36種檢測碳源利用和酶活性的生化試驗，能快速、簡便地對厭氧菌進行生化鑒定[20]。ITEK 2 Compact鑒定系統檢測結果顯示，CICC 10385能產L-脯氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶，能利用麥芽三糖，不能利用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-麥芽糖等，與生胞梭菌鑒定概率百分比[21]為99%，ITEK 2 Compact檢測結果詳見表2。

表2 CICC 10385的ITEK 2 Compact檢測結果Table 2 ITEK 2 Compact test result of CICC 10385

2.3 WGS和ANI分析

2.3.1 WGS和組裝

采用全基因測序儀對CICC 10385進行全基因組從頭測序，測得全基因組大小為4 252 276 bp，含有58個contigs，基因組(G+C)mol%為27.9%。NCBI登錄號為GCA_013867655.1，序列片段歸檔數據庫(sequence read archie，SRA)中登錄號為SRR9967484。

2.3.2 16S rRNA基因預測及序列系統發育分析

通過RNAmmer 1.2預測CICC 10385全基因組中16S rRNA基因序列為1 500 bp，將該序列通過模式菌株序列數據庫進行序列比對，同生胞梭菌(C.sporogenes)、肉毒梭菌(C.botulinum)、孔氏梭菌(C.combesii)、C.tepidum模式菌株序列相似性分別為99.86%、99.72%、99.72%、99.02%，同其余參考模式菌株序列相似性均低于98.65%。以OxobacterpfennigiiDSM 3222T(X77838)序列為外群，鄰接法(neighbor-joining)構建CICC 10385與其近緣模式菌株的系統發育樹(圖2)。結果顯示通過16S rRNA基因序列系統發育分析可以將菌株CICC 10385鑒定為梭菌屬(Clostridiumsp.)。

圖2 鄰接法構建CICC 10385和近緣種16S rRNA 基因序列系統發育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of CICC 10385 and related species

2.3.3 ANI分析

采用ANI Calculator(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)進行CICC 10385和梭菌屬(Clostridiumsp.)內近緣模式菌株的全基因組序列比對分析[22]。結果顯示CICC 10385同生胞梭菌DSM 795T(GCA_001020205.1)模式菌株序列ANI值為99.39%，高于ANI用于細菌種水平鑒定的判定閾值95%～96%[17-18]，同肉毒梭菌(C.botulinum)ATCC 25763T(GCA_001276985.1)、孔氏梭菌(C.combesii)DSM 20696T(GCA_002749945.1)、C.tepidumIEH 97212T(GCA_002008345.1)模式菌株ANI值分別為91.88%、91.87%、88.16%，與梭菌屬其余模式菌株ANI值均低于95%，判定CICC 10385與生胞梭菌為同1個種。通過cgMLST分析，獲得CICC 10385與近緣模式菌株885個核心基因序列系統發育樹(圖3)，在cgMLST系統發育樹中，CICC 10385與生胞梭菌以100%支持率聚在同一分支，且與梭菌屬內其他菌種明顯區分開。采用GGDC 3.0計算獲得CICC 10385同生胞梭菌DSM 795T(GCA_001020205.1)模式菌株序列DDH值為94.8%，同其余參考模式菌株DDH值均低于70%，符合種水平判定標準。綜上，基于WGS的ANI分析，菌株CICC 10385被鑒定為生胞梭菌。

圖3 最大似然法構建CICC 10385和近緣種核心 基因序列系統發育樹Fig.3 Maximum likelihood phylogenetic tree based on core-genome sequences of CICC 10385 and related species

3 結論與討論

本研究采用基于WGS的ANI分析對菌株CICC 10385進行種水平鑒定并首次獲得生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)的全基因組序列。采用微生物學傳統分離培養方法對35 ℃條件下的CICC 10385進行轉接活化，并通過形態學和生理生化特征分析獲得其基礎信息。采用BGISEQ-500全基因測序儀進行WGS，SPAdes軟件進行序列拼接獲得全基因組序列。采用RNAmmer軟件進行16S rRNA基因預測，并對其進行序列比對分析，獲得與CICC 10385親緣關系較近菌種信息。采用ANI Calculator軟件對CICC 10385和近緣菌種進行全基因組ANI等分析。獲得CICC 10385的全基因組大小為4 252 276 bp，含有58個contigs，基因組(G+C)mol%為27.9%。16S rRNA基因序列分析與生胞梭菌(C.sporogenes)、肉毒梭菌(C.botulinum)、孔氏梭菌(C.combesii)和C.tepidum最為近緣，ANI分析與生胞梭菌DSM 795T(GCA_001020205.1)的ANI值為99.39%，與梭菌屬其余菌種ANI值均低于95%，通過cgMLST系統發育分析與生胞梭菌以100%支持率聚在同一分支，且與其他菌種明顯區分開，同生胞梭菌DDH值為94.8%，同其余參考模式菌株DDH值均低于70%，符合種水平判定標準，可明確將CICC 10385鑒定為生胞梭菌。經研究表明基于WGS的ANI分析是準確有效的生胞梭菌種水平鑒定方法。

菌種鑒定通常基于表型和基因型的多相分類鑒定技術方法[23]，隨著測序技術的發展，分子DNA鑒定技術廣泛應用，WGS也變得越來越普遍。自2018年1月起，InternationalJournalofSystematicandEolutionaryMicrobiology要求發表微生物新種需提供基因組測序數據，并在分類中增加這部分的描述。基于WGS的ANI值95%～96%與DDH值70%、16S rRNA基因序列相似性98.65%相對應，可作為原核生物種水平的判定閾值[17-18]。全基因組序列數據不僅能夠提供菌株的分類鑒定信息，還能提供菌株毒力因子、臨床抗微生物藥物產生或耐受以及已知有毒代謝物產生等其他安全特性信息。隨著微生物在各領域的廣泛應用，菌株安全性評價的重要性會愈加凸顯，基于WGS的鑒定方法將提供重要數據信息，其應用會愈加廣泛。

生胞梭菌(C.sporogenes)在食品、醫藥等行業應用廣泛，采用基于WGS的ANI分析對其進行種水平鑒定研究，明確其菌種分類學地位具有重要意義。本研究對CICC 10385的分類地位進行基于全基因組測序平均核苷酸一致性的準確鑒定，為針對該菌及梭菌屬(Clostridiumsp.)等相關菌種鑒定研究提供理論依據，為開展其生物學功能的相關研究奠定基礎。