應用單分子實時測序技術解析醬香型白酒高溫大曲制作過程細菌多樣性

謝丹，吳成，程平言，黃魏，畢遠林，張健，李嶺卓，汪地強，尤小龍，胡峰

(貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司，貴州 習水，564622)

白酒大曲的制作在中國已有2 000多年的歷史，高溫大曲是醬香型白酒釀造所用的唯一糖化發酵劑，通過高溫發酵、培菌來實現制曲過程微生物的演替和酶系的有效積累[1]。曲是產生香味的前驅物質為白酒帶來特有的香味成分。大曲采用生料制曲、添加母曲自然接種、經40 d發酵逐漸形成了以細菌、霉菌和酵母菌為主的群落結構[2]。醬香型高溫大曲的制曲溫度最高可達60 ℃，水分多、溫度高，有利于細菌的增殖，霉菌與酵母由于受制曲環境的影響，使得兩者在大曲中的含量減少[3]，有研究表明在高溫大曲中，細菌占絕對優勢，其數量達90%以上[4-6]。細菌在高溫大曲中的作用主要是產香，其中Bacilluslicheniformis和Bacillusamyloliquefaciens是典型的嗜熱芽孢桿菌，也是大曲中產醬香功能細菌，在發酵體系中能產生大量淀粉酶以及蛋白酶[7-10]，是形成醬香型白酒典型香氣特性的主要菌群。因此，研究醬香型高溫大曲中細菌群落組成結構有利于為后期解析產醬香的獨特風味的作用機制提供理論基礎。

目前，業內對高溫大曲中細菌菌落結構研究方法主要有傳統微生物培養技術和免培養技術。近年來，二代測序平臺—454測序平臺[11]的興起，結束了以Sanger測序為主導的第一代測序時代[12]，隨著核酸檢測技術的發展，以第二代測序為支柱的核酸測序技術仍在各方面的應用中面臨很多挑戰。而以第三代測序技術(PacBio SMRT)為核心的核酸檢測與診斷革新已在生物醫藥領域嶄露頭角，可以實現兆堿基級別超長測序、無擴增基因組修飾檢測，具有快速、實時、高通量的優點，使其在傳染性疾病的及時診斷、精準醫療、藥物研發等領域具有廣泛的應用前景[13-15]。SMRT測序技術在微生物領域研究廣泛，CAO等[16]通過SMRT技術對泡菜鹽水進行16S rRNA 基因全長測序，結果表明Lactobacillusacetotolerans的豐度與酸度呈正相關，且乳酸菌屬內的菌種越多(豐度>1%)，機會致病菌越多；邊燕飛等[17]采用SMRT測序技術全評價嬰幼兒配方奶粉的微生物污染情況，初步建立嬰幼兒配方奶粉的微生物檢測技術。

本研究采用PacBio SMRT三代測序技術，對貴州習酒公司制曲八輪次機械制曲和人工制曲過程中(曲胚入房0 d、一次翻曲7 d、二次翻曲14 d、拆曲40 d 4個工藝環節)的細菌群落多樣性及變化規律進行研究，比較分析了機械制曲和人工制曲的細菌多樣性結構、重要細菌屬種間的差異性，確定了醬香型大曲的優勢菌群，為進一步解析醬香型大曲功能微生物，篩選優良釀造微生物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

高溫大曲樣品采集自貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司制曲第八輪次機械制曲和人工制曲，共采集到8個樣品，其中機械壓曲4個、人工踩曲4個。具體采樣方法為：曲坯入房(AQ)、一次翻曲(YF)、二次翻曲(EF)和拆曲(CQ)，每個工藝環節按發酵倉的門、中、窗不同位置各取3塊高溫大曲，于4 ℃條件下立即帶回實驗室進行粉碎并按1∶1∶1質量比混合為1個樣品。樣品編號為：AQ1、YF1、EF1、CQ1、AQ2、YF2、EF2和CQ2(1表示樣品來自機械曲；2表示樣品來自人工曲)。

1.2 主要設備與試劑

1.2.1 試劑

KOD FX Neo PCR酶，TOYOBO；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金；Power DNA Isolation Kit試劑盒，美國Mibio公司。

1.2.2 設備

SynergyHTX型酶標儀，Gene Company Limited基因有限公司；Legend Micro 21型高速離心機，EPPENDORF；G560 E型振蕩器，美國Scientific Industries公司；9902型 96 well PCR儀，美國ThermoFisher公司；BC/BD-629 HK型臥式冷藏冷凍轉換柜，海爾公司。

1.3 大曲總DNA提取及PacBio SMRT測序方法

DNA提?。喝〈笄?.25 g，按照PowerSoil?DNA Isolation kit試劑盒方法提取DNA。擴增細菌16S全長，選擇27F(5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)為擴增引物。

PCR擴增體系：基因組DNA 5～50 ng/(X μL)、*n F(10 μmol/L) 1 μL、*n R(10 μmol/L) 1 μL、KOD FX Neo 0.4 μL、KOD FX Neo Buf(2X)10 μL、2 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O補至總體系20 μL。

PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性處理30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min/kb，30個循環；72 ℃延伸7 min。使用MagicPure Size Selection DNA Beads磁珠對PCR產物進行純化，使用Nanodrop 2 000定量后，按照質量比1∶1進行混樣測序。

PacBio SMRT測序：純化后的PCR產物由北京擎科生物科技有限公司進行建庫和細菌多樣性分析。

1.4 數據處理及分析

對原始下機subreads使用SMRT Link8.0進行校正得到CCS(Circular Consensus Sequencing)序列，然后使用lima (1.7.0)軟件，通過barcode序列識別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體(UCHIME，ersion 8.1)，得到高質量的CCS序列。使用UNITE為參考數據庫進行物種注釋，基于Sila庫對97%相似水平的操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)代表序列進行分類學注釋分析，利用QIIME軟件對樣本進行Chao1、Shannon和Simpson指數分析及α多樣性分析。使用TBtools軟件對樣品進行熱圖聚類分析，Cytoscape 5.0軟件進行相關性網絡分析。

2 結果與分析

2.1 醬香型高溫大曲制作過程中的細菌多樣性分析

2.1.1 稀釋性曲線分析

稀釋性曲線[18]用于驗證測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。由圖1可知，8個大曲樣品細菌的稀釋性曲線都趨于平坦，說明測序的數據量足夠大，對醬香型高溫大曲中微生物多樣性分析基本覆蓋醬香型高溫大曲中細菌的種類。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 The rarefaction cure of samples

2.1.2 α多樣性分析

α多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性。本研究得到8個大曲樣品α多樣性指數值統計如表1所示。

表1 樣品α多樣性指數Table 1 α-Diersity indexes of samples

在97%相似度水平下共獲得的OTU數為321，其中在EF1的OTU數最高，為77。醬香型高溫大曲樣品的Shannon和Simpson指數表明，機械曲和人工曲從安曲至拆曲環節的α多樣性指數呈先增后降，YF1和EF1的細菌多樣性和物種豐富度明顯高于人工制曲，且隨著發酵時間的進行，到后期的拆曲環節細菌多樣性和物種豐度明顯降低。所有樣品的Coerage指數均>0.99，說明各采樣的高溫大曲樣品文庫的覆蓋率足夠大，樣品中的序列基本被全部測出，測序結果可體現高溫大曲樣品細菌群落多樣性的真實情況。

2.1.3 基于門水平的細菌菌群結構多樣性分析

醬香型大曲制曲8輪次安曲至拆曲環節發酵過程中共檢測10個門，如圖2所示。其中機械曲在發酵過程中檢出10個門、人工曲檢出8個門。機械曲從AQ至CQ發酵大曲中檢測到Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria等10個門；人工曲中未檢出Tenericutes、errucomicrobia。

圖2 門水平的細菌菌群結構Fig.2 Bacteria diersity at phylum leel

在門水平上，機械曲和人工曲整個發酵過程中，皆以Firmicutes為主導菌門，占整個機械制曲和人工制曲的82.7%～99.45%，其中在拆曲環節機械曲占比最高，為99.45%。該結果與戴奕杰等[19]研究醬香型大曲、張雙燕等[20]研究清香型大曲、李申奧[21]研究兼香型大曲發酵過程微生物的研究結論一致，表明高溫大曲在發酵過程中，細菌門水平群落多樣性降低，微生態結構由多菌系轉變為單一的厚壁菌門為主導的發酵門水平上微生態變化的規律性模式。

2.1.4 基于屬水平的細菌菌群結構多樣性分析

人工曲和機械曲在整個制曲發酵過程中共檢出122個細菌屬，其中人工曲在發酵過程中檢出60個細菌屬、機械曲檢出62個細菌屬。圖3為平均相對豐度至少在一個大曲樣品中>1%的菌群結構。

圖3 屬水平的細菌菌群結構Fig.3 Bacteria diersity at genus leel

由圖3可知，人工曲和機械曲從安曲至拆曲發酵大曲中檢測到優勢細菌屬共20個，包括Weissella、Kroppenstedti、Thermoastinomyces、Lentibacillus、Scopulibacillus、Bacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Lactobacillus、Massillia、Acetobacter、Acinetobacter、Cutibacterium、Lactococcus等。其中在AQ環節的優勢菌屬均為Weissella(86.73%、94.46%)。YF2主要以Thermoastinomyces(92.3%)為主要菌屬；YF1環節則以Weissella(23.56%)、Scopulibacillus(24.8%)、Bacillus(21.03%)為主要菌屬。在EF環節，人工曲和機械曲均以多菌屬存在發酵，人工曲以Lentibacillus(42.59%)為主要菌屬、其次是Oceanobacillus(31.22%)；機械曲以Weissella(39.02%)為主要菌屬，其次是Thermoastinomyces(12.87%)、Lentibacillus(8.49%)。CQ環節人工曲和機械曲均以Kroppenstedtia(76.52%、60.25%)為主要菌屬，其次是Lentibacillus(6.19%、35%)。

在屬水平上，在整個制曲發酵過程中機械曲和人工曲細菌多樣性呈動態變化趨勢，在制曲發酵過程中細菌群落結構具有很高的相似性。醬香型高溫大曲曲坯初入房時不處于高溫階段，此時溫度較低濕度較高，適合籠絡環境中多種微生物生長和代謝，隨著溫度的升高實現了對嗜熱微生物的篩選[22]。高通量測序技術在酒曲研究中應用廣泛, 已成功揭示了在不同香型酒曲中的微生物多樣性，相關研究所使用的測序平臺、方法和數據庫具有相似性。目前，關于高通量測序技術在酒曲微生物多樣性相關研究方面層出不窮，WANG等[23]利用Roche 454GS-FLX+system平臺，首次在茅臺大曲中報道了Sporolactobacillaceae、Streptomycetaceae、Pseudomonadaceae、Actinopolysporaceae、Caulobacteraceae、Pseudonocardiaceae、 Nocardiaceae 、Methlobacteriaceae等優勢菌；陳蒙恩等[24]使用Illumina MiSeq PE250分析了陶融型大曲的優勢菌屬主要為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、泛菌屬、明串珠菌屬四大類；張倩等[25]使用Illumina MiSeq 2500平臺解析了濃香型大曲發酵過程中，曲皮、曲心的優勢菌為Bacillales、Lactobacillales、Pseudomonadales、Thermoactinomyces、Weissella、Leuconostoc、Acinetobacter。

2.1.5 基于種水平的細菌菌群結構多樣性分析

人工曲和機械曲在整個制曲發酵過程中共檢出169個細菌種，其中人工曲在發酵過程中檢出80個細菌種，機械曲檢出89個細菌種。圖4為平均相對豐度至少在一個大曲樣品中>1%的菌群結構。人工曲和機械曲從AQ至CQ發酵大曲中檢測到優勢細菌種共26個，包括Weissellacibaria、Weissellaparamesenteroides、Thermoactinomycesulgaris、Scopulibacillusdaqui、Oceanobacillusindicireducens、Oceanobacilluscaeni、Lentibacillusmassiliensis、Kroppenstedtiaeburnea等。圖4結果表明，在AQ環節，Weissellacibaria(81.42%、92.03%)為主要優勢菌種，AQ1、AQ2菌種組成相似，在豐度含量上存在一定差異；在YF環節，優勢菌種在組成上存在較大差異，YF1的優勢菌種為S.daqui(24.8%)、B.licheniformis(21%)、W.paramesenteroides(17.56%)，YF2的優勢菌種為T.ulgaris(92.09%)；在EF環節，人工曲和機械曲的優勢菌種組成差異明顯，菌種多樣性最豐富，EF1的優勢菌種為W.cibaria(31.51%)、S.daqui(12.8%)，EF2的優勢菌種為L.massiliensis(42.59%)、O.indicireducens(19.51%)、K.sanguinis(19.32%)，S.daqui在該環節未被檢出；在CQ環節，人工曲和機械曲的多樣性降低，主要的優勢菌種為K.sanguinis(40.28%/57.88%)、L.massiliensis(6.19%/35.43%)、K.eburnea(36.24%、2.36%)，CQ2環節檢出M.aurea(8.4%)、M.haematophila(4.98%)，而CQ1環節未被檢出。

圖4 種水平上細菌群落組成Fig.4 Bacteria diersity at species leel

選擇相對豐度前50的細菌種進行聚類分析，結果如圖5所示。根據聚類結果可知，每類細菌群落組成較為相似但又區別于其他類別，這進一步表明在曲坯出倉前，特別是在AQ環節，主要是由于優勢菌種的豐度不同和菌種的組成差異而導致樣品存在差異。

圖5 相對豐度前50種細菌水平上相對豐度熱圖Fig.5 Relatie abundance heatmap of top 50 species

但隨著發酵的進行，到CQ環節，機械曲和人工曲中細菌群落較為相似，主要優勢細菌種為K.sanguinis、L.massiliensis、K.eburnea，表明采用機械制曲方式生產的高溫大曲在發酵結束后，與人工制曲的細菌群落基本一致。

2.1.6 相關性網絡分析圖

為進一步研究醬香型高溫大曲制作過程中細菌群落之間的相互關系，選取屬水平總豐度前50的物種，分別計算兩兩細菌屬間的斯皮爾曼(Spearman)等級相關系數，可以獲得物種在環境樣本中的共存關系。人工曲和機械曲物種之間的相關性分析結果如圖6所示。

a-機械曲細菌菌群相關性網絡圖；b-人工曲細菌菌群相關性網絡圖圖6 高溫大曲制作過程細菌菌群相關性網絡圖(屬水平)Fig.6 Correlation network diagram of fungal communities in the process of high-temperature Daqu making at genus leel 注：圖中節點的大小表示物種豐度的大??；物種之間連線的顏色 表示正負相關性，紅色代表正相關，綠色代表負相關

醬香型高溫大曲制作過程中機械制曲和人工制曲細菌菌群之間的相關性結果表明，絕大多數的微生物菌屬之間呈現顯著正相關調節機制。機械制曲細菌群落之間的相關性網絡圖中(圖6-a)，包含52個細菌屬間的正相關關系，2個負相關關系；人工制曲細菌群落之間的相關性網絡圖中(圖6-b)，包含44個細菌屬間的正相關關系，8個負相關關系。這些相互生物學關系構成了發酵過程的基本生物學調控機制，也是發酵過程發酵動力、風味動力形成和調控機制的基本組成[28]。

從機械制曲細菌群落之間的相關性網絡圖中(圖6-a)發現Weissella節點豐度最高，為39.29%；與Oceanobacillus之間存在負相關關系，與Leuconostoc之間是正相關關系，而Oceanobacillus、Leuconostoc兩兩之間存在負相關關系；在整個機械制曲環節，Weissella、Leuconostoc相對豐度逐漸降低，在最后CQ1環節均未檢出該菌屬。Kroppenstedtia與Lentibacillus之間存在正相關關系，Kroppenstedtia在整個機械制曲環節相對豐度從AQ環節的0.19%上升至CQ環節的60%；Lentibacillus從0.01%上升至CQ環節的35%。

從人工制曲細菌群落之間的相關性網絡圖中(圖6-b)發現存在8個負相關關系的節點，其中Kroppenstedtia與Weissella、Enterobacter之間存在負相關關系，且在整個發酵過程中三者的相對豐度均呈現逐漸下降的趨勢。Rikenellaceae_RC9_gut_group、Preotellaceae_UCG-001、Allobaculum和Bacillus4個菌屬之間存在6個節點的正相關性，其中Rikenellaceae_RC9_gut_group、Preotellaceae_UCG-001、Allobaculum存在于EF2環節，且相對豐度均<1%，Bacillus在AQ2、YF2、EF2環節相對豐度逐漸升高，在CQ2環節則未檢出。

從圖6可知，人工曲之間的網絡相關性相互關系節點數低于機械制曲，由此可知，機械制曲在一定程度上可以取代人工制曲，大幅降低勞動強度及生產成本，還能避免工人在惡劣的環境下操作，對推動醬香型白酒行業的機械化與現代化發展具有促進作用。

3 結論

本研究首次應用SMRT三代測序技術對醬香型白酒高溫大曲發酵過程中細菌群落結構進行解析。結果表明在醬香型白酒高溫大曲發酵過程中，機械曲的細菌多樣性明顯高于人工曲。在門水平上，整個發酵過程中皆以Firmicutes為主導；在屬水平上，優勢細菌屬共20個，其中在AQ環節的優勢菌屬均為Weissella；在YF環節，人工曲以Thermoastinomyces為優勢菌屬，機械曲則以Weissella、Scopulibacillus、Bacillus為優勢菌屬；在EF環節，人工曲和機械曲均以多菌屬存在發酵，人工曲以Lentibacillus為主要菌屬，機械曲以Weissella為主要菌屬；在CQ環節細菌多樣性降低，主要以Kroppenstedtia為主要菌屬，其細菌群落組成相似，表明采用機械制曲和人工踩曲的方式制作的高溫大曲在發酵結束后，其細菌群落組成無明顯差別。

機械制曲和人工制曲細菌菌群之間的相關性結果表明，高溫大曲制作過程中細菌群落間存在復雜的相互作用關系，多數細菌屬之間呈顯著正相關調節機制。本研究揭示了醬香型白酒高溫大曲制作過程中，機械制曲和人工制曲的細菌群落結構之間相互作用關系，構成了發酵過程的基本生物學調控機制，為明確醬香型白酒高溫大曲發酵機理提供基礎數據，對推動醬香型白酒行業的機械化與現代化發展具有促進作用。