益生菌對H3N2流感病毒感染的特異性緩解作用

王倩雯，方志鋒，張評滸，王鴻超，朱金林，趙建新,3，張灝,3，陳衛,3，陸文偉,3*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(揚州大學 醫學院，江蘇 揚州，225009) 3(國家功能食品工程技術研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

流感病毒屬于正黏病毒，人流感病毒中的甲型流感曾多次引發世界性大流行。目前，H1N1和H3N2是全球常見的甲型流感病毒，仍然威脅著人類健康[1]。根據“肺-腸軸”理論，腸道菌群對維持呼吸道的健康具有重要的調節作用，腸道微生物及其代謝產物可以調節宿主的免疫應答以抵抗病毒感染。例如，腸道微生物的組分對維持正常的Toll樣受體先天信號至關重，腸內啟動的Toll樣受體信號可誘導肺部的免疫反應，而腸道菌群常見的代謝產物短鏈脂肪酸可通過血液運輸到骨髓，促進造血作用刺激造血干細胞向抗炎環境分化，抗炎因子轉移到呼吸道后抑制呼吸道的炎癥反應[2]。已有研究表明，益生菌可以通過多種作用機制以輔助機體抵抗病毒的侵染，包括提高機體非特異性和特異性免疫反應[3]。宋翔等[4]驗證了植物乳桿菌BLCC2-0125可同時增強黏膜免疫、細胞免疫及體液免疫，為機體在病毒感染早期提供保護。BOSCH等[5]研究發現植物乳桿菌CECT7315/7316與流感疫苗聯用后，可增加流感特異性IgA和IgG。兩歧雙歧桿菌被證實具有調節體液免疫和細胞免疫的作用，可以平衡Th1/Th2免疫應答來抵抗流感病毒的感染[6]。本研究中，使用H3N2流感病毒侵染小鼠模型來探究益生菌對H3N2感染后機體免疫調控影響的異同以及其對腸道菌群結構的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與病毒

實驗使用的菌株BifidobacteriumbifidumFXJCJ9M10(B.bifidum1)，FSDJN705(B.bifidum2)，LactobacillusacidophilusJCM1132(L.acidophilus1)、FFJND6L5(L.acidophilus2)，BifidobacteriumbreeCCFM1025(B.bree1)、CCFM1026(B.bree2)均保藏于江南大學食品微生物保藏中心。所有菌株接種在mMRS(MRS培養基加入0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽)培養基中，37 ℃厭氧培養24 h。使用梯度稀釋和平板計數的方法計算菌懸液的活菌數，確保每只小鼠灌胃的活菌數為2.5×108CFU/d。甲型流感病毒H3N2由禽流感重點實驗室提供。

1.2 實驗試劑和儀器設備

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、K2HPO4、乙醚、濃硫酸、無水硫酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司；EDTA-K2抗凝管，恒康醫療科技有限公司；利巴韋林，北京伊諾凱科技有限公司；增強型BCA蛋白定量檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物(通用型，50×)、RIPA裂解液(強，無抑制劑)、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, H&E)染色液，上海碧云天生物技術有限公司；多聚甲醛，武漢賽維爾生物技術有限公司；IL-6、IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-γ酶聯免疫吸附試驗試劑盒，南京森貝伽生物技術有限公司；糞便Fast DNA提取試劑盒，美國MP Biomedicals公司；TIANgel Mini Purification Kit PCR產物純化試劑盒，杭州倍沃醫學科技有限公司；2×Taq master mix預混液，蘇州康為世紀生物科技有限公司。

ST3100 pH計，奧豪斯儀器有限公司；ME3002E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；MX-S渦旋混勻儀，大龍興創實驗儀器(北京)股份公司；移液器，德國Eppendorf(艾本德)股份公司；DG250厭氧培養箱，英國Don Whitley Scientific 公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Micor21R高速冷凍離心機、Multiskan GO半自動酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；BC-500自動血液分析儀，深圳明瑞生物醫藥電子有限公司；C1000 Touch PCR熱循環儀，美國Bio-Rad Laboratories公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；MB100-2A微孔板恒溫振蕩器，杭州奧盛儀器有限公司；PANNORMIC MIDI數字切片掃描儀，匈牙利3DHistech有限公司；MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 動物實驗

雌性ICR小鼠(3～4周齡)購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物實驗方案及實驗操作均由動物倫理委員會批準(No.20210415)。小鼠被隨機分為空白組、模型組、藥物陽性參照奧司他韋組和6個實驗組(每組8只小鼠)，并進行為期7 d的適應。在病毒感染前兩周開始每天用灌胃的方式對小鼠進行菌懸液(實驗組)或生理鹽水(空白組、模型組和藥物陽性參照奧司他韋組)處理，持續到小鼠犧牲。干預兩周后，除空白組以外，所有組別的小鼠均采用鼻滴的方式感染H3N2病毒株，劑量為5倍50%致命劑量(5LD50)(圖1)。藥物陽性參照組在48 h內使用口服的奧司他韋治療。在病毒感染后，每天稱量小鼠體質量直至犧牲。

圖1 動物實驗時間軸Fig.1 Time line of animal experiments

1.4 血常規檢查

部分血液樣本使用含有EDTA-K2抗凝管收集后，使用自動血液學分析儀，進行血細胞分析。剩余的血液離心后分離得到血清，保存在-80 ℃，用于后續細胞因子檢測。

1.5 肺部損傷和病理分析

用0.8 mL無菌PBS進行3次肺泡灌洗，部分肺泡灌洗液(bronchoaleolar laage fluid，BALF)保存在4 ℃用于乳酸脫氫酶活性檢測和總蛋白檢測，剩余BALF存放于-80 ℃用于后續細胞因子檢測。取左肺葉固定在福爾馬林中，然后使用石蠟包埋，切成5 μm厚度后進行H&E染色。

1.6 細胞因子檢測

血清、BALF和肺組織勻漿上清中的細胞因子：IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、IFN-β、IFN-γ的表達水平利用ELISA試劑盒進行檢測。

1.7 腸道菌群

犧牲前收集小鼠的糞便，使用Fast DNA SPIN提取試劑盒提取糞便中的DNA。PCR擴增3～4區域后，使用TIAN gel Mini Purification Kit 純化PCR產物，經過濃度測定及文庫構建后利用Illumina平臺進行16S測序[7]，然后分析腸道菌群多樣性的變化以及使用線性判別分析(liner discriminant analysis effect size，LEfSe)的方法比較不同組別腸道微生物群落之間的差異。

1.8 數據分析

采用單因子方差分析和Fisher’s LSD test進行差異性分析。數據使用平均值±標準誤差表示。P值<0.05認為具有顯著性差異，與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。 腸道微生物群的數據使用QIIME2 2019.7(https://iew.qiime2.org/)分析。

2 結果與分析

2.1 不同益生菌對H3N2感染小鼠體質量減輕和肺部損傷的影響

在H3N2感染后，模型組小鼠的體質量持續下降。益生菌和奧司他韋的治療在不同程度上緩解了體質量下降的癥狀。其中，B.bifidum2的作用效果最好，L.acidophilus1和L.acidophilus2對體質量下降的作用與奧司他韋相似(圖2-a)。BALF中乳酸脫氫酶活性是細胞毒性指標，模型組小鼠在感染病毒后由于肺部出現損傷，導致BALF中乳酸脫氫酶活性與空白組相比顯著增加。

盡管部分益生菌干預有助于降低乳酸脫氫酶的活性，但與模型組無顯著性差異(圖2-b)。此外，病毒感染造成的肺部損傷會導致組織液外滲，增加BALF中蛋白質含量。使用奧司他韋治療后，BALF中的蛋白質的含量顯著降低，說明肺部損傷得到有效緩解。B.bifidum2、B.bree1和B.bree2顯著降低了BALF中的蛋白質含量，說明這3株益生菌可顯著緩解小鼠的肺部損傷，其中，B.bifidum2效果優于其他菌株(圖2-c)。

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-H3N2病毒感染后5 d內小鼠體質量的變化率；b-小鼠BALF中乳酸脫氫酶活性；c-小鼠BALF中總蛋白含量圖2 益生菌對H3N2病毒感染后體質量減輕和肺部損傷的影響Fig.2 Effects of probiotics on weight loss and lung damage after H3N2 irus infection

根據肺部病理切片可知，空白組小鼠肺部肺泡、氣管周和血管周均無明顯的炎癥細胞聚集(圖3-a)，H3N2感染后，肺泡、氣管周和血管周都出現了嚴重的炎癥細胞浸潤現象(圖3-b)。B.bifidum2(圖3-e)、L.acidophilus2(圖3-g)和B.bree1(圖3-h)干預后，氣管周和血管周基本不見炎癥細胞浸潤(黑色箭頭)，對肺部炎癥的緩解效果優于同種菌的另一菌株。益生菌對H3N2流感病毒感染的緩解效果存在菌株差異，B.bifidum2的作用效果優于其他益生菌。本研究的結果顯示，益生菌的干預在一定程度上可以緩解流感病毒H3N2給機體造成的損傷并存在菌株差異性，其中B.bifidum2的緩解效果最好。

2.2 不同益生菌對H3N2感染小鼠肺部免疫應答的影響

與空白組相比，模型組小鼠感染H3N2病毒后，小鼠肺部的炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β顯著增加，而益生菌干預則有助于抑制炎癥因子的表達(圖4-b～圖4-d)。所有益生菌干預組中，肺部的IL-1β和TNF-α水平均顯著降低(圖4-c、圖4-d)。然而，只有B.bifidum2組中IL-1β和TNF-α水平與空白組相似，其他益生菌干預使得這2種炎癥因子水平低于空白組。另外，B.bifidum2和L.acidophilus2組小鼠肺部IFN-γ與模型組相比顯著降低，恢復至與空白相當水平(圖4-b)。除了奧司他韋和B.bifidum1外，其余干預組均降低了肺部IL-6水平，B.bifidum2、B.bree1和B.bree2作用效果最顯著(圖4-a)。

a-空白組；b-模型組；c-藥物陽性參照奧司他韋組；d-B.bifidum 1組； e-B.bifidum 2組；f-L.acidophilus 1組；g-L.acidophilus 2組； h-B.bree 1組；i-B.bree 2組圖3 益生菌對H3N2流感病毒感染后肺部病理的影響Fig.3 Effects of probiotics on lung pathology after H3N2 influenza irus infection

H3N2感染后，肺部的Ⅰ型干擾素IFN-β較空白組降低，而益生菌干預可以恢復肺部Ⅰ型干擾素的響應，其中L.acidophilus2和B.bree1效果最顯著(圖4-e)。此外，B.bifidum2、L.acidophilus2和B.bree2顯著降低了小鼠肺部IL-10水平(圖4-f)。

綜上，本研究中益生菌菌株具有抑制肺部炎癥因子增加的作用，但不同益生菌的作用效果有顯著的區別。B.bifidum2有助于維持小鼠肺部先天免疫因子IL-1β和TNF-α的水平，盡管TNF-α和IL-1β通常被認為是炎癥因子，但同時也是先天免疫抵抗病原體入侵的重要媒介，因此維持其正常水平對機體發揮先天免疫保護、抵抗病毒感染和減輕組織損傷非常關鍵[8-10]。

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-BALF中IL-6水平；b-BALF中IFN-γ水平；c-肺組織勻漿中TNF-α水平；d-肺組織勻漿中IL-1β水平； e-BALF中IFN-β水平；f-BALF中IL-10水平圖4 益生菌對H3N2流感病毒感染后肺部免疫應答細胞因子水平的影響Fig.4 Effect of probiotics on the leel of cytokines in lungs after H3N2 influenza irus infection

2.3 不同益生菌對H3N2感染小鼠系統免疫應答的影響

與空白組相比，模型組在H3N2感染后血液中的淋巴細胞占比顯著降低(圖5-a)，而中性粒細胞和單核細胞的百分比顯著增加(圖5-b、圖5-c)，說明肺部感染引起了系統免疫響應。奧司他韋治療后，淋巴細胞有明顯的恢復，使用B.bifidum1、B.bifidum2和B.bree2干預也具有恢復淋巴細胞水平的效果(圖5-a)。此外，B.bifidum的干預顯著降低中性粒細胞和單核細胞的水平，B.bree降低中性粒細胞水平，其中B.bree1的干預部分恢復了血液中單核細胞的水平(圖5-b、圖5-c)。與前兩者相比，L.acidophilus對血細胞的影響較小。

H3N2感染后，小鼠血清中IL-6水平顯著增加，與上述系統免疫響應的結果一致。實驗組中，除了L.acidophilus2和B.bree1外，其他菌株均能顯著降低血清中IL-6水平，其中B.bifidum1和L.acidophilus1效果最顯著(圖5-d)。然而，H3N2感染卻顯著降低了血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的水平(圖5-e、圖5-f)，可能抑制了小鼠先天性免疫的響應[10]。在益生菌干預組中，除了B.bifidum1，益生菌干預都增加了小鼠血清中的TNF-α水平。其中，B.bifidum2血清中的TNF-α水平最高(圖5-e)。此外，B.bifidum2顯著恢復了血清中IL-1β水平(圖5-f)。結合肺部較高IL-1β和TNF-α表達水平，B.bifidum2可能激活了機體的先天免疫響應以緩解H3N2感染。

模型組小鼠血清中IL-10水平相較于空白組沒有變化，而B.bifidum1、B.bifidum2、L.acidophilus2和B.bree2均顯著增加了IL-10水平(圖5-g)。益生菌可以通過激活機體的免疫應答以緩解H3N2感染，除了增強先天免疫應答中促炎因子的響應外，益生菌還增加抗炎因子IL-10的水平，維持免疫反應的平衡，以減少抵抗病原體所引起的炎癥反應對機體造成的損傷[11]。B.bifidum除了增加IL-10水平外，還增加了IFN-β在血清中的水平(圖5-h)，Ⅰ型干擾素響應是機體抵抗病毒感染的重要途徑[12]。

2.4 不同益生菌對H3N2感染小鼠腸道菌群的影響

根據“肺-腸軸”理論，腸道微生物對維持呼吸道的健康起到關鍵作用[2]。α多樣性指數eenness和Shannon顯示，H3N2病毒感染后，腸道菌群的多樣性增加，說明呼吸道病毒的感染影響了小鼠的腸道菌群。B.bifidum2和L.acidophilus2可以恢復α多樣性指數(圖6)。

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-淋巴細胞占比；b-單核細胞占比；c-中性粒細胞占比；d-血清中IL-6水平；e-血清中TNF-α水平； f-血清中IL-1β水平；g-血清中IL-10水平；h-血清中IFN-β水平圖5 益生菌對H3N2流感病毒感染后血液中免疫細胞和細胞因子的影響Fig.5 Effects of probiotics on immuno cells and serum cytokines after H3N2 influenza irus infection

A-空白;B-模型;C-奧司他韋;D-B.bifidum 1;E-B.bifidum 2;F-L.acidophilus 1;G-L.acidophilus 2;H-B.bree 1;I-B.bree 2 a-eenness指數；b-Shannon指數圖6 益生菌對H3N2感染小鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.6 Effects of probiotics on α diersity in intestinal flora of H3N2 infected mice

利用LEfSe分析不同益生菌對腸道菌群組成的影響。與空白組相比，模型組小鼠腸道中Lachnospiraceae NK4A136 group，Ruminococcaceae UCG_014，Eubacteriumcoprostanoli和Roseburia等菌屬豐度顯著增加，Odoribacter和Jeotgalicoccus豐度減少(圖7-a)，與SENCIO等[13]研究的結果基本一致。毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)是短鏈脂肪酸的生產者[14]，流感病毒感染可能通過影響這類微生物的豐度來調節腸道中短鏈脂肪酸的水平。益生菌B.bifidum1，L.acidophilus2，B.bree1和B.bree2增加了腸道中Odoribacter的相對豐度。所有益生菌的干預都增加了Tyzzerella和CandidatusSaccharimonas，除了B.bifidum2和B.bree2組只增加了前者(圖7-b、圖7-c)。Tyzzerella，CandidatusSaccharimonas和Odoribacter被認為與宿主免疫調節相關[15-17]，因此，益生菌的通過增加腸道菌群中這些菌屬的豐度，達到調節機體免疫的目的。

B.bifidum可以降低腸道中Eubacteriumcoprostanoligenesgroup和UBA 1819的相對豐度，其中B.bifidum2還降低了Lachnospiraceae NK4A136 group，一定程度上恢復了腸道菌群的平衡。此外，B.bifidum2特異地增加了腸道中的Allopreotella和Helicobacter，并減少了Akkermansia(圖7-b、圖7-c)。L.acidophilus也減少了Akkermansia豐度，其中L.acidophilus1特異地增加了Rikenella和Helicobacter。其中，Akkermansia在呼吸道病毒感染中起到的作用尚不明確[18-19]。益生菌的干預降低其豐度，可能減少了Akkermansia對H3N2感染帶來的負面影響。B.bifidum2和L.acidophilus1組中同時增加了Helicobacter豐度，被認為能有效保護小鼠免受哮喘中組織炎癥的損傷，緩解炎癥細胞浸潤支氣管肺泡[20]。L.acidophilus2對腸道菌群結構的改變較大，增加了Staphylococcus，Eubacteriumnodatumgroup，Corynebacterium1和Aerococcusspp.豐度(圖7-d、圖7-e)。B.bree1 和B.bree2則特異性地分別增加了Ruminococcaceae NK4A214 group和Dubosiella豐度(圖7-f、圖7-g)。綜上，益生菌對腸道菌群組成的調節同時存在共性和菌株特異性。其中，對H3N2緩解效果最好的B.bifidum2特異性地增加了Allopreotella相對豐度，Allopreotella有助于調節宿主的免疫應答和炎癥反應[21-22]，但其作用機制尚不清楚。

a-空白組與模型組LEfSe分析；b-B.bifidum 1組與模型組LEfSe分析；c-B.bifidum 2組與模型組LEfSe分析； d-L.acidophilus 1組與模型組LEfSe分析；e-L.acidophilus 2組與模型組LEfSe分析；f-B.bree 1組與模型組LEfSe分析； g-B.bree 2組與模型組LEfSe分析圖7 益生菌對H3N2流感病毒感染后小鼠腸道菌群組成的影響Fig.7 Probiotics affect the composition of gut flora in mice after H3N2 influenza irus infection

3 結論

綜上，不同益生菌對腸道菌群結構的調節作用存在菌株特異性，可能與其對小鼠系統免疫的調節作用的相關，從而造成對H3N2感染不同的緩解效果。本研究發現了益生菌對腸道菌群組成和宿主免疫系統的調節作用均存在差異，而腸道微生態對免疫系統作用的調節機制尚不明確，有待進一步研究。