不同提取和改性方式小粒咖啡果皮果膠的理化性質及其抗氧化活性

李曉嬌，汪玉潔，楊麗華，唐金山，宋志姣*

1(保山學院 資源環境學院，云南 保山，678000) 2(云南省高校怒江河谷生物質資源高值轉化與利用重點實驗室，云南 保山，678000)

果膠是一種存在于植物細胞壁和胞間層的酸性多糖[1]，主鏈由半乳糖醛酸經α-1,4-糖苷鍵連接形成，側鏈是由半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖等中性多糖組成。果膠具有良好的凝膠性、吸附性、乳化性和增稠性等特性，被廣泛地應用于食品和化妝品等生產領域[2-3]。此外，果膠多糖還具有抗菌、抗氧化、調節免疫和抗癌等生物活性[4]。目前主要從柑橘皮、向日葵盤、香蕉皮和蘋果皮渣中提取果膠[5-7]，從小粒咖啡果皮中提取果膠還鮮有報道。

通常加工1 t小粒咖啡鮮果會產生0.5 t皮渣(包括果皮、果肉)，云南小粒咖啡植區每年鮮果處理生產皮渣約39.68萬t[8]。這些咖啡皮渣除部分用作堆肥外，絕大部分作為廢棄物丟棄，造成環境污染和資源浪費。近年來，已有將小粒咖啡果皮制成咖啡果皮茶、果汁酒等產品，但均是小批次試驗，未形成規模化生產。課題組前期研究發現，小粒咖啡果皮中果膠含量約為15%，其果膠水解物有較好的抑菌活性[9]。目前，果膠提取方法多達十余種，其中微波輔助法和超聲波輔助法提取可以縮短果膠的提取時間、節約溶劑，且較大限度地保留原料的天然活性，保護果膠的組分結構[10-11]。然而，不同提取方法對果膠的理化性質和生物活性的影響不同，馬麗蘋等[12]通過酸堿法和高壓蒸汽法改性蘋果果膠，改性后的蘋果果膠具有更好的抗氧化活性，因此，本研究采用鹽酸浸提法(traditional acid extraction, TAE)、微波輔助法(microwae assisted extraction, MAE)和超聲波輔助法(ultrasound assisted extraction, UAE)提取小粒咖啡果皮中的果膠，再通過酸堿改性和熱改性獲得2種改性果膠，并在分析改性前后果膠理化性質的基礎上，進一步測定改性前后果膠對DPPH自由基、·OH、·O2-和ABTS陽離子自由基的清除能力，為小粒咖啡果皮資源的綜合開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小粒咖啡(CoffeaarabicaL.)果皮由云南保山老基地咖啡有限公司提供；無水乙醇、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、三氟乙酸，分析純，重慶川東化工有限公司；間羥聯苯、鄰苯三酚，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；聚環氧乙烷(poly ethylene oxide, PEO)、聚乙二醇(poly ethylene glycol, PEG)、巖藻糖(Fuc)鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)，美國Sigma公司；PEO/PEG(分子質量:202 400，134 300，72 750，31 440，3 870，615 Da)，安捷倫；DPPH、ABTS，國藥集團化學試劑有限公司(沃凱)。

U2600紫外-可見分光光度計，日本島津公司；PL-GPC50高效凝膠滲透色譜，美國Agilent公司；ICS5000離子色譜、Nicolet is5FTIR紅外光譜儀，美國賽默飛公司；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；N-1001D旋轉蒸發儀，東京理化公司；Noa-Nano450掃描電鏡，美國FEI公司；550脫殼機，河南伍德機械設備有限公司；DZF 602真空干燥機，上海一恒科學儀器有限公司；XM-500UF智能靜音超聲儀，小美超聲儀器(昆山)有限公司；G80F23CN3L-C2微波爐，廣州電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠提取方法

1.2.1.1 小粒咖啡果皮樣品處理

小粒咖啡鮮果→[料液比：1∶8.5(g∶mL)，25 ℃]水浸泡12 h→脫殼機脫殼→果皮放置通風處，太陽光下自然晾曬2～3 d直至水分含量為16.52%→粉碎機粉碎(20 000 r/min，3 min)→過80目篩→果皮粉末→加水(15 mL/g)煮沸10 min使酶失活→加入80%乙醇溶液脫色(10 min/次，重復3次)→干燥，粉碎備用。

1.2.1.2 TAE法

稱取10.00 g上述小粒咖啡果皮樣品于250 mL錐形瓶內，按料液比1∶25 (g∶mL)加入pH 1.5的鹽酸溶液(0.032 mol/L)，于60 ℃水浴中提取90 min，冷卻后抽濾，濾液于40 ℃減壓濃縮至原體積的1/3，冰水浴冷卻后加入1.5倍體積的無水乙醇進行醇析，減壓過濾，用75%乙醇洗滌，除去醇溶性雜質，濾渣于40 ℃下真空干燥至恒重，得果膠固體，稱重計算得率[9]。

1.2.1.3 MAE法

稱取10.00 g小粒咖啡果皮樣品于250 mL錐形瓶內，按料液比1∶20 (g∶mL)加入pH 1.5的鹽酸溶液，于微波功率700 W下提取5 min，冷卻后抽濾，濾液按照1.2.1.2所述方法獲得果膠計算得率。

1.2.1.4 UAE法

稱取10.00 g小粒咖啡果皮樣品于250 mL錐形瓶內，按料液比1∶20 (g∶mL)加入pH 1.5的鹽酸溶液，在超聲功率為200 W，溫度為40 ℃的條件下提取35 min。冷卻后抽濾，濾液按照1.2.1.2所述方法獲得果膠計算得率。

1.2.2 小粒咖啡果皮果膠改性方法

1.2.2.1 酸堿改性

稱取1.50 g小粒咖啡果皮果膠于250 mL錐形瓶中，加入100 mL、55 ℃的蒸餾水，配制得到質量濃度為15 mg/mL的果膠樣品溶液。待果膠全部溶解后，緩慢加入3 mol/L NaOH溶液至pH 10.0，并置于55 ℃水浴中45 min。于室溫下，加入3 mol/L HCl溶液調節pH值至3.0，在室溫下靜置過夜(12 h)。然后加入3 倍體積的無水乙醇，攪拌產生大量的白色絮狀沉淀，過濾，濾渣于50 ℃真空烘干得到酸堿改性小粒咖啡果皮果膠[12]。改性果膠得率按公式(1)計算。

(1)

式中：m0，小粒咖啡果皮果膠質量，g；m1，改性小粒咖啡果皮果膠質量，g。

1.2.2.2 熱改性

稱取1.50 g小粒咖啡果皮果膠于250 mL錐形瓶中，加入50 mL、55 ℃的蒸餾水，配制得到質量濃度為30 mg/mL的果膠樣品溶液。待果膠溶解后，調節pH值至4.0，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在115 ℃下維持45 min，取出冷卻至室溫，50 ℃下減壓蒸餾至原液體積的1/3，然后向濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，攪拌產生白色絮狀沉淀，過濾，濾渣于50 ℃真空烘干得到熱改性小粒咖啡果皮果膠[12]。

1.2.3 小粒咖啡果皮果膠理化性質測定

1.2.3.1 酯化度測定

稱取0.10 g果膠，充分溶解于100 mL蒸餾水中。加入2～3滴酚酞指示劑，用濃度為0.10 mol/L的NaOH溶液標定，當溶液變為粉紅色并保持1 min不變色時，記錄所消耗的NaOH溶液體積(1，mL)，即為初始滴定度。再加入濃度為3.00 mol/L的NaOH溶液2.5 mL，搖勻，5 min后加入濃度為3.00 mol/L的HCl溶液2.5 mL，振蕩直至粉紅色消失。然后再加入2～3 滴酚酞指示劑，用0.10 mol/L NaOH溶液滴定至再次呈粉紅色并保持1 min不變色，記錄NaOH溶液的消耗體積(2，mL)，根據公式(2)計算酯化度。

(2)

1.2.3.2 微觀結構測定

將果膠樣品粘于導電膠片上，噴金后在加速電壓為20 k的條件下利用掃描電子顯微鏡觀察9種果膠的表面形貌。

1.2.3.3 高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)測定分子質量

準確稱取(10±0.05)mg果膠樣品和標準品于20 mL樣瓶中，向其中分別加入10 mL的流動相(水+0.2 mol/L NaNO3+0.01 mol/L NaH2PO4, pH 7.0)制成2 mg/mL溶液，加熱攪拌溶解，待樣品完全溶解后，微孔濾膜(0.22 μm)過濾，然后轉移至2 mL進樣瓶。以不同分子質量的PEO/PEG標準品作對照，制備標準曲線，測定樣品的分子質量。測定條件：溫度40 ℃，溶劑流速1.0 mL/min，流動相：水+0.2 mol/L NaNO3+0.01 mol/L NaH2PO4(pH 7.0)，標樣：PEO/PEG，進樣體積100 μL；色譜柱：2× PLgel 8 μm aquagel-OH Mixed-M 7.5 mm×300 mm，檢測器：示差折光檢測器。

1.2.3.4 單糖組分測定

取干凈的色譜瓶，精確稱量多糖樣品(5±0.05)mg，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，105 ℃加熱6 h，通N2吹干。加入甲醇清洗，通氮氣吹干，重復清洗2～3次。加入無菌水溶解，轉入色譜瓶中待測。

將上述乙酰化產物采用DionexTMCarboPacTMPA20(150 mm×3.0 mm，10 μm)液相色譜柱測定；進樣量為5 μL；流動相A(0.1 mol/L NaOH)，流動相B(0.1 mol/L NaOH和0.2 mol/L NaAc)，流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；洗脫梯度：0 min (A相)∶(B相)=95∶5，30 min (A相)∶(B相)=80∶20，30.1 min (A相)∶(B相)=60∶40，45 min (A相)∶(B相)=60∶40，45.1 min (A相)∶(B相)=95∶5，60 min (A相)∶(B相)=95∶5。

1.2.3.5 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)測定

用KBr壓片法測定小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜。將果膠樣品干燥至恒重，按照1∶100的質量比取少量果膠與KBr混合均勻后壓片，在紅外光區為400～4 000 cm-1用FTIR掃描16次，掃描分辨率為4 cm-1。

1.2.4 小粒咖啡果皮果膠的抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測定

取2.0 mL 0.2 mmol/L新制的DPPH溶液(95%乙醇溶解)分別與2.0 mL不同質量濃度的小粒咖啡果皮果膠樣品(0.2～3.2 mg/mL)充分混勻，在室溫下避光反應20 min后，在517 nm處測定吸光度，記為A1，以95%乙醇溶液代替上述體系中的DPPH溶液，在517 nm處測定吸光度，記為A2，以蒸餾水代替上述體系中果膠樣品溶液，在517 nm處測定吸光度，記為A0，按公式(3)計算DPPH自由基清除率。

(3)

1.2.4.2 ·OH的清除能力測定

取0.6 mL 6 mmol/L FeSO4溶液分別與2.0 mL不同質量濃度的果膠樣品溶液(0.2～3.2 mg/mL)混勻后，再加入0.6 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，充分混勻后于室溫下反應10 min，再分別加入6 mmol/L水楊酸0.6 mL混勻，繼續反應10 min，在510 nm處測得吸光度為A1。在上述反應體系中，以無水乙醇代替水楊酸，測定吸光度為A2，以蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度為A0，按1.2.4.1中的公式(3)計算清除率。

1.2.4.3 ·O2-清除能力測定

取不同質量濃度(0.2～3.2 mg/mL)的果膠樣品溶液0.8 mL，分別加入2 mL Tris-HCl緩沖液(16 mmol/L pH 8.2)混合均勻，在25 ℃水浴30 min后，加入20 ℃水浴的鄰苯三酚樣品溶液0.2 mL混勻，室溫下靜置35 min，測定混合液在325 nm處的吸光度A1。在上述反應體系中，以蒸餾水代替鄰苯三酚樣品溶液測得A2，以蒸餾水代替樣品測得的吸光度為A0，按公式(3)計算·O2-的清除率。

1.2.4.4 ABTS陽離子自由基清除能力測定

用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4、0.2 mol/L)配制7.4 mmol/L的ABTS溶液，加入2.6 mmol/L的過硫酸鉀，室溫下避光反應16 h，然后再用上述磷酸鹽緩沖液稀釋，使溶液在734 nm處的吸光度A0為(0.70±0.02)，得ABTS陽離子自由基稀釋液。將果膠樣品用磷酸鹽緩沖液配制成質量濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL的溶液，分別量取0.2 mL不同質量濃度果膠樣品溶液與2.0 mL ABTS陽離子自由基稀釋液混合，搖勻，室溫避光反應20 min后，在734 nm處測定吸光度(A1)；同時將0.2 mL不同質量濃度的果膠溶液與2 mL 磷酸鹽緩沖液振搖20 s使其混合，并室溫避光反應20 min以后，在734 nm處測定吸光度(A2)。按公式(3)計算ABTS陽離子自由基清除率。

1.3 數據處理

所有試驗均進行3次重復試驗。采用Origin 2019進行作圖，SPSS 22.0進行多重比較分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 提取方法對果膠得率的影響

3種不同方法提取的果膠得率如圖1所示，得率大小為：MAE法(7.24%)>UAE法(6.88%)>TAE法(5.21%)。通過多重比較分析，MAE法和UAE法的果膠得率無顯著差異(P>0.05)，而TAE法果膠得率較MAE和UAE法差異顯著(P<0.05)。可能原因是MAE法的熱效應和UAE法的空化效應和機械效應對小粒咖啡果皮的細胞壁的分解破壞程度大，使細胞更容易破裂，從而細胞中更多的多糖等物質被分解出來，所得果膠得率相對較高[13]。

圖1 不同提取方法的果膠得率Fig.1 Pectin yield of different extraction methods

2.2 改性小粒咖啡果皮果膠的理化性質

3種方法提取的果膠分別經過酸堿改性和熱改性共得到6種不同的改性果膠，其理化性質見表1。TAE法熱改性果膠(A3)產率36.50%，略高于酸堿改性果膠(A2)產率35.69%；MAE法的2種改性果膠產率均達到40%以上，高于其他2種方法所得的改性果膠；UAE法的2種改性果膠產率最低，為28.44%和28.69%。與改性前相比，6種改性果膠的GalA含量均顯著提高(P<0.05)。改性前3種方法提取的果膠酯化度均高于30%，而改性后酯化度均顯著降低(P<0.05)，且均降低到25%以下，且酸堿改性的果膠酯化度最低。果膠在酸堿改性時，堿處理產生β-消除反應能使同聚半乳糖醛酸骨架解聚，同時也使酯化度降低；酸處理則優先脫下側鏈上的中性糖[12,14]，因此，果膠通過酸堿改性后，其GalA含量增加，而酯化度下降；果膠熱改性，高溫高壓會引起β-消除反應和脫甲酯基作用[15]，從而也導致酯化度下降，GalA含量增加。

式中，W′維數為s×m，θ2為閾值，維數為m×1，f2（I2）為輸出層的傳遞函數，可采用Sigmoid函數或Purelin函數。

如表1所示，9種果膠的阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)均含量相對較高，其次是鼠李糖(Rha)、和葡萄糖(Glc)。改性前果膠的中性糖含量均高于改性后果膠，且TAE法提取的果膠中性糖含量最高。改性后果膠的糖醛酸含量均高于改性前的果膠，且MAE法提取的果膠改性前后的糖醛酸含量均高于TAE法和UAE法提取的果膠。以Rha與GalA相對含量比表示果膠的分支程度，比值越高說明分支度更高[16]。表1中Rha/GalA的比值為0.10～0.30，表明不同提取方式和改性方法得到的9種果膠有較多支鏈，且果膠局部降解較少，其結構主要為RG-I型[17]。

表1 改性前后小粒咖啡果皮果膠得率和理化性質 單位：%

2.3 小粒咖啡果皮果膠的掃描電鏡分析

圖2是改性前后小粒咖啡果皮果膠的掃描電子顯微鏡圖，未改性的A1、B1和C1果膠表面凹凸不平但質地比改性后的果膠緊密，其中C1果膠表面凸起較多，并且有特殊的折疊結構和少量的孔隙；A1和B1果膠質地緊密無明顯孔隙結構。酸堿改性果膠(A2、B2、C2)質地都較為疏松，其中B2果膠表面有顆粒狀堆積，C2果膠存在空腔結構，而A2果膠無明顯顆粒堆積和孔隙結構。熱改性果膠(A3、B3、C3)與未改性和酸堿改性果膠相比表面質地更加疏松，存在空腔結構或片層結構。不同的提取方法及改性方法使得果膠的分子質量、多糖含量、酯化度等都發生了不同程度的變化，從而導致果膠多糖存在結構形態上的差異。

圖2 改性前后小粒咖啡果皮果膠的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of natie and modified C.arabica pomace pectin

2.4 不同提取方式和改性對分子質量的影響

利用HPGPC法對改性前后的果膠分子質量進行測定，結果如表2所示。改性前后的果膠分子質量在1.42×102～6.79×104Da，不同提取方式和改性方法制備的小粒咖啡果皮果膠多糖分子質量分布不均一，均由3種不同分子質量的組分峰組成(峰1，峰2，峰3)。9種果膠的峰2和峰3的分散系數(Mw/Mn)均接近1.0，說明分子質量分布比較集中，峰1的分散系數(Mw/Mn)均大于2.0，分布比較分散。比較這9種果膠峰面積較大的峰(即峰1)的重均分子質量：A1>A3>A2，B1>B2>B3，C1>C2>C3，而A3、B3、C3這部分的果膠含量相對較高(峰面積較大)；比較峰2的重均分子質量：A1>A3>A2，B1>B3>B2，C1>C3>C2，而A3、B2、C2這部分的果膠含量相對較高；比較峰3的重均分子質量：A1>A3>A2，B1>B2>B3，C1>C2>C3，而A1、B1、C2這部分的果膠含量相對較少。其中酸堿改性和熱改性的重均分子質量均小于未改性果膠的分子質量，這可能是由于酸堿和高壓加熱的條件下，果膠分子發生β-消除反應和去酯化反應，使得果膠主鏈斷裂，生成一些聚半乳糖醛酸低聚物[18]。

表2 改性前后小粒咖啡果皮果膠的分子質量Table 2 The relatie molecular weight and its distributionof natie and modified C. arabica pomace pectin

續表2

2.5 小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜分析

圖3 改性前后的小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜圖Fig.3 The FTIR of natie and modified C.arabica pomace pectin

2.6 改性小粒咖啡果皮果膠的抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除能力

由圖4可知，隨著果膠質量濃度的增加，9種不同果膠對DPPH自由基的清除率也不同程度地增加。當果膠質量濃度為0.2 mg/mL時，3種未改性的果膠A1、B1、C1對DPPH自由基的清除率均低于酸堿改性和熱改性的果膠；當果膠質量濃度大于0.8 mg/mL時，酸堿改性的果膠A2、B2、C2對DPPH自由基的清除率均高于未改性和熱改性的果膠，而A1和A3，B1和B3之間對DPPH自由基的清除率無顯著差異。當果膠樣品質量濃度為6.2 mg/mL時，9種果膠對DPPH自由基的清除率均大于90%，其中酸堿改性果膠A2、B2、C2對DPPH自由基的清除率最高，分別為97.36%、99.12%和98.11%，IC50值分別為0.58、0.52、0.53 mg/mL(表3)，高于南酸棗果膠多糖(IC50=3.08 mg/mL)[22]。可見酸堿改性的小粒咖啡果皮果膠具有更好的清除DPPH自由基的能力。A2、B2、C2果膠的GalA含量均高于未改性和熱改性的果膠，因此具有更強的抗氧化活性。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖4 不同小粒咖啡果皮果膠對DPPH自由基的清除率Fig.4 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against DPPH radical

表3 改性前后小粒咖啡果皮果膠清除4種自由基的IC50值Table 3 The IC50 alues of natie and modified C.arabica pomace pectin

2.6.2 ·OH的清除能力

由圖5可知，隨著果膠質量濃度的增加，9種果膠對·OH的清除率也有不同程度的增加。當果膠質量濃度為0.02～6.4 mg/mL時，A2果膠對·OH的清除率要高于A1和A3，果膠質量濃度小于0.08 mg/mL時，A3果膠低于A1果膠。當果膠質量濃度高于1.6 mg/mL時，對·OH的清除率由高到低依次為：A2>A3>A1。果膠質量濃度為0.02～6.4 mg/mL時，對·OH的清除率由高到低依次為：B2>B3>B1，當果膠質量濃度為0.08 mg/mL時，B1和B3對·OH的清除能力無顯著差異。在果膠質量濃度為0.08 mg/mL時，B1和B3對·OH的清除率分別為41.20%和41.64%，無顯著差異，而B2果膠的清除率則小于前兩者，僅為32.54%。當果膠質量濃度大于1.6 mg/mL時，對·OH的清除率由高到低依次為：C2>C3>C1。

當果膠質量濃度為6.4 mg/mL時，9種小粒咖啡果皮果膠(A1～A3,B1～B3,C1～C3)對·OH的清除率均大于90%，其中TAE法提取和改性得到的A1、A2、A33種果膠均大于96%，3種提取方法中，均為酸堿改性的果膠A2、B2、C2的清除率最高，分別為：99.97%、98.56%和99.23%，IC50值分別為0.77、0.68、0.78 mg/mL(表3)，高于南酸棗果膠多糖(IC50=3.69 mg/mL)。果膠多糖中的羧基可以絡合Fe2+，從而抑制Fe2+與H2O2生成·OH，同時果膠多糖中的羧基和羥基可作為氫供體與·OH反應[23-25]。而A2、B2、C2中的GalA含量相對較高(表1)，由此可知，GalA相對含量較高的酸堿改性小粒咖啡果皮果膠對·OH有更強的清除能力。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖5 不同小粒咖啡果皮果膠對·OH的清除率Fig.5 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against ·OH

2.6.3 ·O2-的清除能力

由圖6可知，9種果膠均隨著果膠質量濃度的增加·O2-的清除率也在不同程度的增加。當果膠質量濃度為1.6 mg/mL時，熱改性(A3)和未改性果膠(A1)對·O2-的清除能力無顯著差異。質量濃度小于1.6 mg/mL時，果膠對·O2-的清除率為A2>A1>A2，而當果膠質量濃度高于1.6 mg/mL時，對·O2-的清除率為A2>A3>A1。在果膠濃度為1.6～6.4 mg/mL時，對·O2-的清除率為B2>B3>B1，當果膠質量濃度小于1.6 mg/mL時，清除能力為B3>B2>B1。C1和C3在質量濃度在0.2～0.8 mg/mL時，對·O2-的清除率無顯著差異。當果膠質量濃度高于0.8 mg/mL時清除率為C2>C3>C1。

當果膠質量濃度為6.4 mg/mL時，9種小粒咖啡果皮果膠(A1～A3,B1～B3,C1～C3)對·O2-的清除率均大于90%，3種提取方法中，酸堿改性的果膠A2、B2、C2的清除率最高，分別為99.87%、97.28%和99.92%，IC50值分別為0.49、0.68、0.54 mg/mL(表3)，由于UAE法提取的果膠GalA含量最高，因此對·O2-的清除能力高于TAE和MAE法提取的果膠。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖6 小粒咖啡果皮果膠對·O2-的清除率Fig.6 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against ·O2-

2.6.4 ABTS陽離子自由基的清除能力

由圖7可知，隨著果膠質量濃度的增加9種果膠對ABTS陽離子自由基的清除率也隨之增加。在果膠質量濃度為0.2～0.4 mg/mL時，A1、A2和A3對ABTS陽離子自由基的清除率的差異不顯著，當果膠質量濃度高于0.8 mg/mL時，呈現A2>A3>A1的規律。在果膠質量濃度高于1.6 mg/mL時，對ABTS陽離子自由基的清除率呈現B2>B3>C1的規律。果膠質量濃度低于1.6 mg/mL時，B2對ABTS陽離子自由基的清除率均小于B1和B3，B1和B3無顯著差異。呈現B2>B3>B1的規律，當果膠質量濃度為6.4 mg/mL時，9種小粒咖啡果皮果膠(A1～A3, B1～B3, C1～C3)對ABTS陽離子自由基的清除率均大于90%，其中MAE法和UAE法提取的果膠(B1～B3, C1～C3)清除率均大于96%，3種提取方法中，酸堿改性的果膠A2、B2、C2的清除率最高，分別為99.12%、99.97%和99.82%，IC50值分別為0.76、0.89、0.90 mg/mL(表3)。

a-TAE法果膠;b-MAE法果膠;c-UAE法果膠圖7 小粒咖啡果皮果膠對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.7 Scaenging capacity of different C.arabica pomace pectins against ABTS cationicradical

3 結論與討論

本研究采用TAE、MAE和UAE 3種方法提取小粒咖啡果皮中的果膠，其中MAE法果膠得率最高，3種方法提取的果膠的半乳糖醛酸含量為C1>B1>A1，酯化度為A1>B1>C1；改性前后9種果膠(A1～A3, B1～B3，C1～C3)的阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)均相對較高。果膠酸堿改性和熱改性后，3種方法提取的果膠的GalA含量均升高，酯化度均降低。2種改性方法中，酸堿改性的果膠的GalA含量高于熱改性果膠，MAE法酸堿改性后的果膠(B2)GalA含量最高。改性果膠質地都較為疏松、有空腔結構或片層結構。改性前后的果膠分子質量在5.62×102～6.79×104Da，均由3種不同分子質量的組分峰組成。不同的提取方法及改性方法使得果膠的分子質量、多糖含量、酯化度等都發生了不同程度的變化，從而導致果膠多糖存在結構形態上的差異。

9種果膠對DPPH自由基、·OH、·O2-和ABTS陽離子自由基的清除率呈現質量濃度依賴效應，其中當果膠質量濃度大于3.2 mg/mL時，清除能力均為酸堿改性果膠>熱改性果膠>未改性果膠。超聲波輔助提取和酸堿改性果膠的半乳糖醛酸含量較高，且對4種自由基的清除能力也相對較好，因此果膠中半乳糖醛酸的含量和對自由基的清除能力存在正比關系。本研究為以小粒咖啡果皮為原料的天然食源性抗氧化劑的開發提供了理論基礎和科學依據，具有潛在的經濟效益和社會效益。