枸杞熟化產物類黑精大孔吸附樹脂的純化

胡云峰，潘悅，陳君然,朱彥華

1(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300457)2(早康枸杞股份有限公司,寧夏 中寧,755100)

枸杞是我國藥食兩用的傳統藥材，富含營養物質與活性成分，是良好的滋補品，具有極大的開發價值和廣闊的應用前景。類黑精是美拉德反應所產生的一種結構非常復雜的褐色大分子高聚物，具有較強的抗氧化、抗菌、促進鐵吸收等多種活性[1-2]。最近科研人員對于采用美拉德反應制備類黑精活性成分，及對其結構、活性分析方面進行了大量研究[3-4]。毛肇潔等[5]在對小磨香油的研究中發現類黑精有較強的抗氧化活性。劉志等[6]將人參高溫蒸煮后，發現天冬氨酸與人參皂苷上水解產生的糖發生美拉德反應生成的類黑精增強了人參的抗氧化活性。趙天琦等[7]報道，經九蒸九曝加工制備的黑參富集了大量類黑精物質，具有更強的抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。

熟化枸杞子是基于美拉德反應，將枸杞經高溫、高濕熟化而成，熟化期間產生了大量的黑褐色類黑精物質，抗氧化活性也有了較大提高[8]。目前純化類黑精的方法，主要有樹脂純化與超濾分離，其中，王月麗[9]利用超濾技術將黑蒜類黑精根據分子質量的不同分為了4個組分；何健等[10]利用X-5型樹脂精制了曲霉型豆豉類黑精；王明慧[11]在研究糯米藕類黑精中采用了大孔樹脂與凝膠層析聯用的方法進行純化。本實驗在乙醇溶液提取熟化枸杞類黑精的基礎上，采用大孔吸附樹脂法，根據現有研究與類黑精特性，選擇樹脂極性以弱極性與非極性為主、相差較大的比表面積、平均孔徑與粒徑的樹脂。比較6種大孔吸附樹脂[12-13]對枸杞熟化產物類黑精的靜態吸附、靜態解吸和動態解吸中的效果，并測定了純化前后類黑精的抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

中寧干枸杞:產于寧夏，早康枸杞股份有限公司，含水量3%；大孔吸附樹脂(AB-8、HPD-100、CAD-40、X-5、D101、D312)，東鴻化工有限公司；乙醇(分析純)，天津市北方天醫化學試劑廠；鹽酸、氫氧化鈉、DPPH、水楊酸硫酸鐵、氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸，均為分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HY-2調速多用振蕩器，國華電器有限公司；DBS-100電腦全自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；SHZ-D循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 熟化枸杞的制備

采用王娜[8]的方法，將枸杞洗凈，瀝干，裝入聚乙烯盤中，每盤枸杞不多于30 g。置于60 ℃的烘箱中加熱處理48 h，即得到熟化枸杞。

1.3.2 枸杞熟化產物類黑精粗提物的制備

參照文獻[14-16]的方法，將熟化枸杞研磨碾碎，用稀釋后的乙醇溶液在45 ℃下提取，抽濾獲得提取液，加入無水乙醇至乙醇體積分數達到70%。透析2 d，以除去游離的單糖、氨基酸等小分子物質，最后冷凍干燥得到類黑精粗提物。

1.3.3 類黑精的檢測波長

類黑精顏色呈深褐色，其最大吸收峰值在420 nm左右[17]，因此本研究選取420 nm作為熟化枸杞類黑精的檢測波長。將提取出的類黑精粗提物，分別配制成質量濃度0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL溶液，在420 nm下測定吸光度。在420 nm下的吸光度值隨著枸杞熟化產物類黑精濃度的升高而升高，兩者間呈顯著的正相關,y=0.808x+0.029 8(R2=0.995 8)，符合朗伯比爾定律，因此選擇420 nm作為類黑精的檢測波長是可行的。

1.3.4 大孔吸附樹脂的篩選

采用靜態吸附解析法評估大孔樹脂純化的效果，樹脂的預處理工藝參照鄭佳佳[18]的方法，具體工藝如下：

無水乙醇中浸泡24 h→用純水洗至流出液不渾濁→5% HCl溶液通過樹脂柱，浸泡2 h左右→純水洗至中性→2% NaOH溶液通過樹脂柱，浸泡2 h左右→純水洗至中性→待用

表1 大孔吸附樹脂的物理特性Table 1 Physical properties of macro-orous resins

1.3.5 靜態吸附容量及吸附率的計算

準確稱取樹脂5 g置于100 mL錐形瓶中，加入30 mL 5 mg/mL的類黑精粗提液，在振蕩器中振蕩24 h，充分吸附后過濾，分別測定樹脂吸附前后樣液在420 nm下的吸光度值，吸附容量按公式(1)計算；吸附率按公式(2)計算：

(1)

(2)

式中：Q，吸附容量，mg/g;ω0，樣液中類黑精的質量分數，mg/g；ω1，吸附液中類黑精的質量分數，mg/g；，吸附液體積，mL；m，樹脂質量，g；E，吸附率，%。

1.3.6 解析率的計算

取吸附后的樹脂加入一定濃度的30 mL乙醇溶液進行解吸。置于振蕩器中振蕩24 h，充分解吸后過濾，測定解吸液在420 nm下的吸光度值，解析率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：B，解析率，%；ω2，解析液中類黑精的質量分數，mg/g；1，解析液體積，mL；ω0，樣液中類黑精的質量分數，mg/g；ω1，吸附液中類黑精的質量分數，mg/g；，吸附液體積，mL。

1.3.7 解析劑濃度對類黑精解析率的影響

為探究最佳洗脫液濃度，稱取5 g飽和的AB-8樹脂，分別加入20%、40%、60%、80%、100%體積分數的乙醇溶液作為洗脫劑，測定洗脫液在420 nm下的吸光度值，計算解析率。

1.3.8 類黑精的動態吸附試驗

調整自動收集器，每2 min收集1管樣品[19]，用48 mL 40%的乙醇溶液進行洗脫，于420 nm下測定收集樣品的吸光度值。

1.3.9 總還原力的測定

參考韓慧敏[20]的方法，采用鐵氰化鉀法在700 nm波長處測定其吸光度值。吸光度值越大，說明還原能力越強。

1.3.10 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種穩定的以氮為中心的自由基[19]，參考陳放[21]的方法，取1 mL樣品加入4 mL 95%乙醇溶液和2 mL 0.05 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，搖勻，黑暗反應30 min，在517 nm波長處測定其吸光度值。DPPH清除率按公式(4)計算：

(4)

式中：A0，空白對照組的吸光度值；A1，樣品組的吸光度值；A2，不加反應劑的樣品的吸光度值。

1.3.11 ·OH清除能力

參考王文祥[22]的方法，采用水楊酸捕獲Fenton反應[·OH]法，在510 nm波長下測其吸光度值，·OH清除率按公式(5)計算：

(5)

式中：A0，空白對照組的吸光度值；A1，樣品組的吸光度值；A2，不加反應劑的樣品吸光度值。

1.3.12 數據分析

本實驗設置3個平行組，數據在Excel中統計與整理，在Origin 2017中繪圖，應用SPSS 19統計軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同型號樹脂對類黑精的靜態吸附效果

由于不同型號樹脂的粒徑孔徑不同，導致樹脂吸附率不同。由圖1可以看出，不同型號的樹脂吸附率依次是AB-8(弱極性)>D101(非極性)>D312(非極性)>X-5(弱極性)>CAD-40(弱極性)>HPD-100(非極性)，其中AB-8型樹脂的吸附率最高為70.24%，吸附容量為6.322。分析原因可能是由于AB-8型樹脂對比同為弱極性的X-5樹脂與CAD-40樹脂，其孔徑更為合適，X-5樹脂的孔徑過大，CAD-40樹脂的孔徑過小都不利于吸附。AB-8 樹脂的孔徑略大于D101、D312、HPD-100三種樹脂更有利于吸附。在P<0.05水平下AB-8型樹脂吸附率顯著高于其他組，AB-8型樹脂吸附效果最好，可以推出枸杞熟化產物類黑精為弱極性物質。

圖1 六種型號樹脂對類黑精的吸附率Fig.1 Adsorption capacities of six resins of melanoidins 注：圖中不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著(下同)

2.2 不同型號樹脂對類黑精的靜態解吸效果

由圖2可知，各個類型樹脂的解析率均在80%以上，其中AB-8、CAD-40、HPD-100這3種樹脂的解析率較高，且這3種樹脂的解析率均在88%以上，AB-8略高于其他2種樹脂，其解析率為88.84%。6種樹脂之間的解吸率不存在顯著性差異(P<0.05)，結合吸附率的實驗結果，AB-8的吸附率和解析率都是最高的，因此可以選取AB-8大孔吸附樹脂作為類黑精的純化分離樹脂。

圖2 六種型號樹脂對類黑精的解吸率Fig.2 Desorption capacities of six resins of melanoidins

2.3 不同乙醇體積分數對類黑精解析率的影響

根據王明慧[11]以及何健等[10]樹脂純化類黑精的方法，使用乙醇溶液作為解吸劑。由圖3可知，類黑精的解析率隨乙醇溶液體積分數逐漸提高，呈現先增高后降低的趨勢，其中20%的乙醇由于體積分數過低，無法使類黑精被充分解析出來，此時類黑精的解析率最低，僅為77.98%；而當使用100%乙醇時則可能由于乙醇極性過大，不利于類黑精的析出，類黑精的解析率也較低，為83.12%；乙醇溶液為40%、60%、80%時，類黑精的解析率均較高，在95%以上，綜合考慮成本，選擇40%的乙醇溶液作為解析劑。

圖3 不同體積分數的乙醇溶液對AB-8樹脂靜態解吸結果Fig.3 Effects of different alcohol concentrations on static desorption capacity of AB-8 resin

2.4 40%乙醇溶液與AB-8樹脂對類黑精的動態解吸效果

圖4為采用弱極性AB-8樹脂作為純化分離樹脂、40%乙醇溶液作為解析劑的類黑精動態解吸效果。

圖4 40%的乙醇溶液的動態洗脫曲線Fig.4 Dynamic desorption cure of 40% alcohol concentration

采用40%的乙醇溶液作為解析劑，可以很好地洗脫吸附在AB-8樹脂上的類黑精，以1.5 mL/min的速度洗脫，在第8管時即可到達頂峰，第18管時已基本洗脫干凈，由此可見，40%的乙醇溶液對于類黑精的洗脫速度快、且洗脫出的類黑精比較集中。因此，采用40%的乙醇溶液可以把類黑精基本洗脫完成，且峰形較對稱、無拖尾。

2.5 最佳純化條件下獲得的熟化枸杞類黑精活性分析

為檢測純化效果及純化工藝對類黑精活性的影響，分別測定了類黑精純化前后的總還原力、DPPH自由基清除能力及·OH清除能力。其中S1為樹脂純化前粗類黑精，S2為純化后類黑精。

還原能力是評判物質抗氧化活性高低的重要指標，一般與抗氧化能力呈正相關。由圖5可知，對照組(維生素C)與S1組分、S2組分存在顯著性差異。在相同濃度下，對照組的總還原力均比純化前后的類黑精要高，但經過純化后的S2組分的總還原力比純化前S1組分的總還原力要高，從0.836提高到了1.36。

圖5 純化工藝對總還原力的影響Fig.5 Effects of resin purification on total reducing power

由圖6可知，S2組分與對照組不存在明顯差異，與S1組分存在明顯差異(P<0．05)。經過純化以后，類黑精的DPPH自由基清除能力得到明顯提高，S2組分的DPPH自由基清除能力不僅比S1組分高，與對照組相比也略有提高，分別提高了35.43%和2.88%。

圖6 純化工藝對DPPH清除能力的影響Fig.6 Effects of resin purification on DPPH eliminating ability

由圖7所示，S2組分與對照組和S1組分存在明顯差異(P<0.05)。純化后的S2組分的·OH清除能力明顯要高出對照組與未純化的S1組分，純化前的S1組分與對照組的·OH清除率分別為39.03%和42.26%，兩者相差不大，但純化后的S2組分的·OH清除率達到了65.77%，相比于對照組與S1組分清除率提高了1倍。由上述結果可知，經此工藝純化后的類黑精純度有了較大提高，活性也保持較好。

圖7 純化工藝對·OH清除能力的影響Fig.7 Effects of resin purification Hydroxyl radical scaenging ability

3 結論

基于美拉德反應對枸杞進行了熟化處理，對其美拉德反應的活性產物類黑精進行了分離純化，研究大孔吸附樹脂對類黑精的吸附、解析效果的影響，以及乙醇解析劑濃度對熟化枸杞類黑精的解析效果影響，最終確定采用AB-8型大孔吸附樹脂作為純化樹脂，40%的乙醇溶液作為解吸劑，在該工藝條件下類黑精的洗脫速度快、洗脫出的類黑精也較為集中。本研究與王明慧[11]純化糯米藕類黑精選取的樹脂相同，都是AB-8型樹脂，何健等[10]純化曲霉型豆豉類黑精篩選的樹脂為X-5，洗脫劑濃度為60%，選取的樹脂多為弱極性，根據極性相似相容原理，說明熟化枸杞類黑精也為弱極性物質。解吸劑乙醇溶液的體積分數不同，相對應的極性也不同，會影響類黑精在乙醇溶液的溶解度，類黑精在合適的洗脫劑濃度下，解析率相應較高，不同產物的類黑精極性會有所不同。

對其純化產物進行抗氧化分析發現，與純化前相比，純化后產物的總還原力從0.836提高到1.36，·OH清除能力提高了26.74%，DPPH自由基清除能力提高了35.43%，與鄭佳佳[18]在研究酒糟類黑精UF3組分樹脂純化后·OH清除率提升了10.06%；鄭金德[23]在研究啤酒類黑精中，非極性UF4組分經樹脂純化后的抗氧化性最強一致。綜上，說明AB-8型樹脂可以富集類黑精中有效成分，純化之后的類黑精表現出較強的抗氧化活性。為之后進一步研究熟化枸杞類黑精提供了基礎研究方法，對熟化枸杞類黑精的結構與活性有待進一步研究。