分子蒸餾法降低紅棗酒中甲醇含量

趙巖，李根，張瑩，初樂，路遙，馬寅斐，朱風濤，余曉斌*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南，250014) 3(山東農業工程學院 食品科學與工程學院，山東 德州，251100)

紅棗(ZizyphusjujubaMill.)又名棗子，鼠李科棗屬植物棗樹果實，在我國分布極廣，據統計我國現有上萬公頃棗樹，年產鮮棗140多萬t，占世界總產量的98%[1]。紅棗營養價值豐富，含有豐富的有機酸、生物堿類、三萜皂苷類、黃酮類化合物以及各種維生素，具有良好的營養保健作用[2]。目前市場上紅棗大部分仍作為原棗進行銷售，由于深加工技術不足導致了大量的損失，我國紅棗制品主要為基于初級加工的干棗、棗粉等，而其深加工產品，產品如棗酒、棗醋等相對較少，使得紅棗資源的利用價值大大降低[3]。

紅棗酒具有酒精度低、營養價值豐富、口感酸甜適宜等特點，可提高機體免疫力、防治骨質疏松、軟化血管等[4]，SAN等[5]研究發現，使用稀釋過的紅棗酒給小鼠灌胃7 d后發現小鼠腹腔內巨噬細胞的吞噬指數顯著提高，說明紅棗酒具有提高機體免疫力的作用；PAWLOWSKA等[6]利用HPLC/PDA/ESI-MS法對紅棗酒中的黃酮類化合物含量進行了測定并對其抗氧化能力進行了研究，結果表明紅棗酒中的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性。但是紅棗中果膠含量十分豐富，導致紅棗在制汁過程中產生大量的甲醇，不僅會對紅棗酒的品質產生不良影響，同時過量的甲醇也會對人的健康造成危害[7]，目前常見的降低果酒中甲醇的方法通常是利用膠體物質吸附果汁中的果膠甲酯酶，從而降低其活性，或是通過添加酚酸來降低果膠甲酯酶的活性[8]，但不含果膠甲酯酶的酶制劑往往活性較低，對果膠分解不徹底，從而導致酶解效果不好，出汁率較低。如何能夠在不影響出汁率的情況下降低紅棗汁中的甲醇，同時最大程度保留其原有的風味，是紅棗酒產業急需解決的問題。

分子蒸餾技術是近年來發展起來的一種高效、環保的分離技術，它是一種非平衡的短程液-液蒸餾技術[9]，由于不同物質分子的平均自由程不同，因此其表面蒸發速率有差異，在高真空條件下，分子受熱逸出液體表面，使液體中不同成分在遠低于其沸點的溫度下分離[10]。分子蒸餾技術具有真空度高、操作溫度低、受熱時間短、分離程度高等優點，目前已廣泛用于天然藥物精制及香精香料提純等行業[11]。本研究通過分子蒸餾技術，將酶解后紅棗汁中的甲醇分離出來，從而達到降低紅棗酒中甲醇含量的效果，通過響應面法優化分子蒸餾最佳工藝條件，并與未蒸餾的紅棗酒進行品質對比，探討分子蒸餾在降低甲醇含量方面的工藝適用性，以期為分子蒸餾降低甲醇含量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗、灰棗，購于新疆，4 ℃貯藏；果漿酶，諾維信；乙醇、甲醇、叔戊醇，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

KL70-5分子蒸餾儀器，德國TA公司；TRACE ISQ氣相色譜-質譜聯用儀，美國賽默飛科技公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；WAY阿貝折光儀，上海光學儀器五廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅棗酶解液制備工藝流程

將無病害、新鮮紅棗用自來水沖洗干凈，加入80 ℃水，按料水比1∶3(g∶mL)混合浸泡1 h后打漿，在勻漿加入0.5 g/kg果漿酶在50 ℃下酶解1.5 h，后經40目尼龍濾袋壓榨取汁，此為紅棗酶解液。

1.3.2 紅棗酶解液甲醇分子蒸餾清除

將150 mL紅棗汁酶解液加入到分子蒸餾設備進料器中，依次打開散熱泵、刮板泵、真空泵和冷卻泵，當設備真空度到達0.1 Pa后往冷阱中倒入適量液氮。打開加熱器調整至設定的溫度，調節刮板轉速和進料流速，對紅棗酶解液進行分子蒸餾。記錄輕組分餾出液的體積，同時以未處理酶解液甲醇質量(mg)作為對照。

1.3.3 分子蒸餾清除甲醇條件優化

控制蒸餾溫度30 ℃、進料流速20 mL/min、刮板轉速100 r/min。分別研究蒸餾溫度(20、30、40、50、60 ℃)，進料流速(10、15、20、25、30 mL/min)，刮板轉速(50、100、150、200、250 r/min)對150 mL紅棗酶解液中甲醇含量的影響，并計算清除率，分析蒸餾效果。

1.3.4 分子蒸餾響應面優化設計

根據單因素確定3個水平，以蒸餾溫度、進料流速、刮板轉速為試驗因素，以酶解液甲醇清除率為響應值，采取Box-Behnken中心組合法進行3因素3水平實驗設計，見表1。

表1 響應面實驗水平表Table 1 Factors and leels in response surface design

1.3.5 分子蒸餾對紅棗酒品質的影響

將300 mL紅棗酶解液平均分為2份，通過優化后的分子蒸餾工藝進行蒸餾處理的為蒸餾組；不經分子蒸餾的為未蒸餾組。后加入釀酒酵母在20 ℃發酵7 d，發酵結束后對發酵液進行可溶性固形物、酒精度、香氣成分檢測。

1.4 測定方法

1.4.1 甲醇含量測定

參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》，采用氣相色譜法測定甲醇含量，甲醇清除率按照公式(1)計算。

(1)

1.4.2 可溶性固形物測定

將待測液充分混勻，用阿貝折光儀檢測。

1.4.3 酒精度測定

使用酒度計檢測。

1.4.4 香氣含量測定

參照文獻[12]的方法，采用氣相色譜-質譜聯用儀對紅棗酒的揮發性成分進行測定。

1.4.4.1 樣品處理

量取5 mL樣品于頂空進樣瓶中，加入1 g NaCl，進樣瓶40 ℃平衡30 min，將老化處理過的萃取頭(SPME Fiber Assembly：DB/CAR/PDMS, Autosampler)插入進樣瓶中，頂空吸附30 min，解吸。

1.4.4.2 氣相色譜與質譜條件

色譜柱：TG-WAXMS色譜柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，最后以8 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣(He)流速1.2 mL/min，壓力52.76 kPa；進樣量1 μL；不分流。

電子電離離子源：電子能量70 e，質量掃描范圍m/z35～450，0.2 scans/s；傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度280 ℃。

1.4.4.3 數據處理

采用NIST MS search 2.0數據采集及分析，根據保留指數及譜庫檢索確定風味物質；采用內標法對各揮發性成分進行定量，內標為2-辛醇(質量濃度16.33 mg/L)。

1.5 數據處理

實驗數據使用Origin 9.0、SPSS 20、Excel等軟件對數據進行統計、分析，每個試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 蒸餾溫度對甲醇清除率效果的影響

分子蒸餾系統的特點是蒸發器與冷凝器間距很小(20～50 mm)，蒸餾溫度是決定物料分離效果的關鍵因素，溫度越高，蒸汽分子的平均自由程越大，物料的分離效果越好[13]。由圖1可知，甲醇清除率隨蒸餾溫度的升高而逐漸增大，溫度>30 ℃后趨勢變緩，40 ℃時甲醇清除率達到74.94%，之后清除效果趨于飽和。但考慮到較高溫度對果酒中香氣及營養成分產生較大損失，因此選取蒸餾溫度為40 ℃。

圖1 蒸餾溫度對紅棗酶解液中甲醇清除效果的影響Fig.1 Effect of distillation temperature on the remoal of methanol in jujube enzymatic hydrolysate 注：甲醛質量為餾出液中的含量(下同)

2.2 進料流速對甲醇清除效果的影響

由圖2可知，隨著進料流速的增大，發酵液中甲醇清除效果逐漸降低，可能是當蒸餾溫度和刮板轉速一定的情況下，進料流速大則意味著在蒸發器表面停留時間短，液體厚度增加，導致受熱時間減小，單位面積上需要蒸發的物料量增加，不利于甲醇的分離[14]。當進料流速15 mL/min時，甲醇清除率最大為79.46%，繼續減小進料流速差異不明顯，對甲醇清除達到飽和狀態，但導致發酵液過度受熱[15]。綜上所述，選取的最適進料流速為15 mL/min。

圖2 進料流速對紅棗酶解液中甲醇清除效果的影響Fig.2 Effect of feeding speed on the remoal of methanol in jujube enzymatic hydrolysate

2.3 刮板轉速對甲醇清除效果的影響

刮板通過圍繞蒸發器壁轉動，盡可能提高物料的駐留時間和適合的薄膜厚度，進而到達更好的傳熱分離效果[16]。若轉速過小，物料無法形成均勻的薄膜，導致分離效果降低，提高轉速可以減小液體薄膜厚度，增加傳熱傳質效果，提高分離效率[17]。由圖3可知，發酵液中甲醇含量隨著刮板轉速的提升而逐漸降低，清除率逐漸提高。當刮板轉速為200 r/min時，甲醇清除率最大為79.88%，當刮板轉速繼續提高后，甲醇清除率呈下降趨勢，這可能是刮板轉速過高導致蒸發面液膜飛濺，甲醇分子劇烈運動易于與飛沫碰撞而返回液面中，使分離效果下降，這與黃會娜等[18]的研究結果一致。

圖3 刮板轉速對紅棗酶解液中甲醇清除效果的影響Fig.3 Effect of scraping speed on the remoal of methanol in jujube enzymatic hydrolysate

2.4 響應面優化分析

2.4.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

根據單因素試驗結果，本試驗以甲醇清除率為響應值，分析蒸餾溫度、進料流速、刮板轉速對響應值的影響，響應面設計方案和結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface methodology

用Design-Expert軟件對試驗數據進行多項式回歸擬合，并進一步研究和優化影響甲醇清除率的因素，做響應面圖。多元回歸擬合，得到甲醇清除率與各因素的二次方程模型為：

Y=79.43+3.97A-1.60B+1.28C-2.06AB+4.6AC+2.22BC-4.63A2-7.57B2-4.46C2

根據表2響應面設計實驗結果進行方差分析，結果由表3所示。得出的回歸模型對酶解液甲醇清除率性達到顯著水平(P<0.01)，表明該回歸方程模型極顯著，失擬項差異性不顯著(P>0.05)，說明建立的回歸模型對試驗結果的擬合情況誤差較小，能夠很好地表現出各影響因素和響應值之間的聯系并能較好地預測試驗值。其中，3個因素蒸餾溫度(A)、進料流速(B)、刮板轉速(C)，二次項交互作用的AB、AC、BC以及二次項A2、B2、C2對甲醇清除率均有顯著影響(P<0.05)，3個因素對酶活性的影響大小依次為蒸餾溫度>刮板轉速>進料流速。

表3 回歸模型甲醇清除率方差分析Table 3 ANOA of response surface model for pectinesterase

2.4.2 響應面分析

響應面圖的坡度陡峭程度決定了兩者交互作用對甲醇清除率的影響大小，坡度越陡峭，兩者作用越顯著[19]。由圖4可知，蒸餾溫度和進料流速、蒸餾溫度和刮板轉速、進料流速和刮板轉速的響應面圖坡度陡峭，說明該三者的交互作用對響應值的影響顯著(P<0.05)，其他作用不顯著(P>0.05)，這與表3方差分析的結果一致。

通過Design-Expert 10軟件分析得到酶解液分子蒸餾最佳工藝條件為蒸餾溫度46.96 ℃、進料流速14.35 mL、刮板轉速223.72 r/min，預測在此工藝條件甲醇清除率為81.23%。考慮到工藝可行性，將上述工藝條件優化為蒸餾溫度47 ℃，進料流速14 mL/min，刮板轉速223 r/min，測定實際甲醇清除率為82.11%，與預測值較接近，采用響應面優化的工藝條件較可靠。

a-蒸餾溫度和進料流速；b-進料流速和刮板轉速；c-蒸餾溫度和刮板轉速圖4 交互作用響應面圖Fig.4 Response surface plots for the interactie effects

2.5 分子蒸餾對紅棗酒品質的影響

2.5.1 分子蒸餾對紅棗酒發酵效果的影響

由表4可知，分子蒸餾過程中有部分水蒸出，提高了酶解液的可溶性固形物含量，更利于酵母發酵，成品酒的酒精度更高，分析可知同等條件下酒精度提高約1%(ol)，同時經過分子蒸餾后，果酒甲醇含量也低于未蒸餾組。綜上所述，分子蒸餾作為發酵前處理工藝能夠顯著提高發酵效率，降低成品酒中甲醇含量。

表4 分子蒸餾對紅棗酒發酵效果的影響Table 4 Effect of molecular distillation on the fermentation of jujube wine

2.5.2 分子蒸餾對紅棗酒香氣成分的影響

香氣是評價紅棗酒品質好壞的重要指標[20]，本實驗通過GC-MS對蒸餾與未蒸餾組紅棗酒香氣成分進行定量分析，共檢測出35種香氣成分，其中酯類物質17種，醇類物質7種，酸類物質7種，其他成分4種。如表5所示，經過分子蒸餾后紅棗酒中香氣化合物總量(146.37 mg/L)高于未蒸餾組(123.34 mg/L)。酯類物質是紅棗酒中主要的香氣成分，其中乙酸酯多產生于酵母發酵階段，具有怡人果香和酒香味[21]，分子蒸餾在減壓加熱過程中雖然溫度不高，但也伴隨著一些果香味的逸出，因此發酵后乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯等含量略有降低，但酯類物質總量蒸餾組(101.58 mg/L)顯著高于未蒸餾組(90.23 mg/L)。醇類物質是發酵過程中主要的次級代謝產物，其中異戊醇作為含量最高的物質，是構成酒香味的主要成分；酸類物質可增加紅棗酒風味的復雜性和濃郁性，其中辛酸含量最高，給予酒更好的水果香味；同時一些萜烯類和醛類物質賦予了紅棗酒玫瑰香、蘋果香等香氣，使紅棗酒的香味更加協調、厚重[22]。由表5可知，蒸餾組的醇類、酸類、醛類物質的含量均高于未蒸餾組，可能是分子蒸餾后糖度上升，特征香氣成分含量也得到顯著提升，紅棗酒的香氣也更加濃郁。

表5 分子蒸餾對紅棗酒香氣成分的影響Table 5 Effect of molecular distillation on the aroma components of jujube wine

3 結論

通過對分子蒸餾溫度、進料流速、刮板轉速對紅棗酶解液甲醇清除率的影響，結合響應面設計優化清除甲醇的最適工藝條件為蒸餾溫度47 ℃，進料流速14 mL/min，刮板轉速223 r/min，在此工藝條件下，酶解液甲醇清除率達到82.11%。通過與未經分子蒸餾紅棗酒品質對比發現，分子蒸餾能使酶解液糖度上升，使紅棗酒酒精度和香氣成分含量提升，提高紅棗酒品質。

分子蒸餾作為一種近幾十年發展起來的分離技術廣泛應用于天然物質的提取與分離，對在紅棗酒中去除甲醇的應用研究較少，本文針對紅棗酒中清除甲醇的工藝條件及適用性進行了探討，為果酒加工產品在甲醇控制方面提供理論支持。