酚酸接枝殼聚糖對殼聚糖膜性能的影響及其保鮮應用

黃宸，劉偉佳，謝晶,2,3，李立,2,3，薛斌,2,3，李曉暉,2,3*， 邵則淮,2,3，卞曉軍,2,3，孫濤,2,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部冷庫及制冷設備質量監督檢驗測試中心，上海，201306)

目前所使用的食品包裝主要由石油基塑料制成的，處理不當會影響環境和人身安全。此外，大多數食品包裝很難保持食品的新鮮度。在某些情況下，可食用和可生物降解的膜有替代塑料包裝的潛力。殼聚糖(chitosan，CS)是一種源自幾丁質的天然線性氨基多糖，是自然界中僅次于纖維素的第二豐富多糖。它可生物降解、無毒、可再生，同時，它對多種細菌有抑制作用[1]，因此殼聚糖在食品包裝領域的應用引起了廣泛的關注。殼聚糖膜抗氧化活性較低，導致其在食品工業中的應用受到限制。在殼聚糖膜中摻入或接枝抗氧化劑可以增強其抗氧化活性[2]。

酚類化合物是植物界最豐富的次生代謝產物。酚酸是一類重要的酚類化合物，已被證明具有優異的抗氧化活性[3]。近年來，研究人員致力于將天然酚酸與殼聚糖接枝來改善其抗氧化性。結果表明，酚酸接枝殼聚糖膜是一種新型的抗氧化膜，與沒食子酸和咖啡酸接枝改變殼聚糖膜的物理性質，增強其生物活性，包括抗氧化和抗菌活性[4]。此外，接枝度不同的沒食子酸殼聚糖衍生物復合膜的物理性能和抗氧化性各異[5]。研究發現，5種羥基苯甲酸接枝殼聚糖膜的性能取決于羥基苯甲酸的類型和接枝率[6]。這些研究表明，酚酸的種類、接枝度和成膜方法將對酚酸接枝殼聚糖膜的性能有顯著的影響。目前，接枝度相近的不同種類酚酸殼聚糖膜的對比研究還較少見。

本研究將咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸分別通過碳二亞胺介導的偶聯反應制備接枝度相近的酚酸殼聚糖衍生物，進而得到了酚酸接枝殼聚糖膜以評估其物理性質、生物活性和對南美白對蝦的保鮮效果。為殼聚糖膜在食品包裝領域的應用提供了參考價值。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、Folin-Ciocalteu試劑、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、1,1-二苯基-2-吡啶基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、殼聚糖(脫乙酰度90%，分子質量100 kDa)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3 - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC]，中國上海生工生物技術有限公司；咖啡酸(caffeic acid，CA)、阿魏酸(ferulic acid，FA)、對香豆酸(p-coumaric acid, PA)，中國上海麥克萊恩生化科技有限公司。以上所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

U-3900紫外光譜儀，日立有限公司；Nicolest Is 10傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾儀器有限公司；DCP-KZ300智能拉伸試驗機，成都明馳有限公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；FOSS 8400 凱式定氮分析儀，福斯分析儀器有限公司；FE28-Bio 臺式pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 酚酸接枝殼聚糖衍生物(酚酸-g-CS)的制備

酚酸-g-CS樣品采用文獻[7]的方法制備。制備100 mL乙酸溶液(1%體積分數)，將干燥的2.0 g殼聚糖添加到其中，邊加入邊攪拌。PA和EDC(分別為0.324和0.383 4 g)溶解在乙醇(10 mL，70%體積分數)中，將NHS(0.230 2 g)加入其中，在冰浴中攪拌1 h。將含有酚酸的乙醇溶液逐滴加入殼聚糖溶液中，并在冰浴中攪拌40 min。將混合物在黑暗中反應24 h后離心(10 000 r/min，30 min)。最后將上清液裝入普通透析袋(14 kDa)用去離子水透析3 d，將樣品冷凍干燥。

FA-g-CS采用相同方法合成，FA、NHS和EDC的量分別為0.180 2、0.115 1和0.191 7 g。

CA-g-CS采用同樣的方法合成，咖啡酸、NHS和EDC的量分別為0.194 2、0.115 1和0.191 7 g。

1.4 酚酸-g-CS共價結構表征

紅外光譜：通過傅里葉變換紅外光譜儀在波數4 000～400 cm-1測量。其分辨率為2 cm-1。

紫外光譜：樣品的紫外光譜(0.2 mg/mL)在紫外分光光度計上獲得，掃描范圍：250～400 nm。

殼聚糖衍生物樣品的接枝率采用Folin-Ciocalteu法測定[8]。建立酚酸的標準曲線以獲得樣品的總酚含量。

1.5 酚酸接枝殼聚糖膜

采用SUN等[9]的方法制備。制備100 mL乙酸溶液(1%體積分數)，然后向其中加入PA-g-CS(2.0 g)。將2.5 g明膠和0.6 g甘油分別放入PA-g-CS溶液中，將溶液在60 ℃下混合60 min，超聲脫氣并涂在塑料板上(30 cm×20 cm)。膜在室溫下干燥2 d后從板上剝離，測試前在容器(25 ℃，50%相對濕度)中保存2 d。CS、FA-g-CS和CA-g-CS膜分別使用上述方法制備與樣品質量相同的樣品。

1.6 酚酸-g-CS膜的性能

1.6.1 膜的物理性質

透光率：通過紫外分光光度計(200～800 nm)評估膜樣品(1 cm×4 cm)的透光率。

厚度：使用螺旋千分尺評估膜厚度。

不透明度：使用紫外可見分光光度計測量。計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，膜在600 nm處吸光度；d，膜的厚度。

水分含量和水溶性：根據文獻[10]測量。

膜的水蒸氣透過率(water apor permeability，WP)根據文獻[10]測定，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：m，稱量瓶增加的質量，g；d，膜的厚度，mm；t，稱量瓶質量增加的時間，h；A，膜的穿透面積，cm2；ΔP，膜兩側的蒸氣壓差(27 ℃時為3 567 Pa)。

1.6.2 機械性能

根據LIU等[6]的方法，將矩形膜(100 mm×6 mm)安裝在智能拉伸試驗機上，測量其力學性能，包括楊氏模量(young modulus，YM)、斷裂伸長率(elongation at break，EB)和抗拉強度(strength of extension，TS)。

1.6.3 復合膜的抗氧化性

根據文獻[10]對膜的DPPH清除能力和其總酚釋放量進行了測定。膜的總酚釋放量采用Folin-Ciocalteu法測定。根據DPPH溶液和樣品的混合物的吸光度來測定膜的DPPH清除能力。DPPH清除能力由混合物的吸光度(波長為517 nm)測量，計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，空白吸光度；A1，混合物吸光度。

1.6.4 抗菌活性

采用YOON等[11]的方法進行測定。將200 μL的細菌懸浮液(106CFU/mL)均勻分布在含有瓊脂的板上，將直徑6 mm的膜放置在含有瓊脂的板上。將培養皿在37 ℃下孵育36 h，測量膜周圍抑制區的直徑。無菌水和山梨酸鉀分別作為空白和陽性對照。

1.7 南美白對蝦的保鮮

1.7.1 樣品處理

將膜應用于保鮮南美白對蝦來評估酚酸-g-CS膜的保鮮能力。選擇質量相近的活蝦(15.00±1.00) g，隨機分為5組。蝦用冷水清洗并用酚酸-g-CS膜(10 cm×10 cm)包裹。然后將蝦在4 ℃下儲存，并在儲存期間對其指標進行評估[12]。

1.7.2 失重率

稱量南美白對蝦在儲存期間的質量，失重率表示蝦的初始體質量和每天體質量之間的百分比損失。

1.7.3 pH值

根據HUANG等[12]的方法，使用數字pH計評估蝦樣品的pH值。

1.7.4 總揮發性鹽基氮(total olatile base nitrogen，TB-N)

使用凱式定氮分析儀測量，以mg/100 g表示。

1.7.5 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)

采用ZHANG等[5]的方法。將蝦(5.0 g)與TCA(25 mL, 10%)混合并均質30 s。懸浮液用雙層濾紙過濾，移液管吸出2 mL濾液，在試管中與TBA溶液(2 mL)充分混合。將其置于水中(100 ℃)45 min后快速冷卻至室溫，測量混合物的吸光度(532 nm)。

1.7.6 微生物評價

菌落總數參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[13]，結果表示為lg CFU/g。

1.7.7 感官評價

由隨機選取的6名評估員(3名男性和3名女性)根據HUANG等[12]的方法進行。評估員通過對蝦的顏色、質地、氣味和整體可接受性來給出感官評分(10分為最理想，1分為最低質量)。

1.8 統計分析

所有實驗均重復3次，并使用SPSS 20.0通過方差(ANOA)分析數據。如果P<0.05，則認為差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 酚酸-g-CSs的表征

2.1.1 傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)分析

圖1 CS和酚酸-g-CSs的FT-IR圖譜Fig.1 FT-IR spectra of CS and phenolic acid-g-CSs

2.1.2 紫外光譜

由圖2可知，殼聚糖的紫外光譜中沒有出現明顯的吸收峰，而FA-g-CS、PA-g-CS和CA-g-CS的紫外光譜在275～325 nm出現了特征吸收峰。特征吸收峰是由酚酸苯環的π體系引起的。這一結果與文獻[16]的報道一致，這也表明酚酸成功接枝到殼聚糖。

圖2 殼聚糖和酚酸接枝殼聚糖的紫外光譜Fig.2 U spectra of chitosan and phenolic acid-grafted chitosan

2.1.3 酚酸-g-CSs的接枝率

根據表1中的反應條件，酚酸-g-CS的接枝率分別為54.7、53.5、55.7 mg/g。

表1 酚酸-g-CSs的制備條件及其接枝率Table 1 Preparation conditions of phenolic acid-g-CSs and its grafting ratios

2.2 復合膜的特性

2.2.1 膜的物理性能

如圖3所示，與殼聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜的紫外透射率較低。表明酚酸接枝可以有效提高CS膜的紫外線阻擋性能，這主要是由酚酸基團的紫外線吸收引起的[16]。CA-g-CS膜具有最低的紫外線透光率，表明它在包裹食品時可以有效地延緩紫外線引起的氧化。

圖3 殼聚糖和酚酸接枝殼聚糖膜的透光率Fig.3 Light transmission of chitosan and phenolic acid-grafted chitosan films

由表2可知，4種膜的厚度沒有明顯差異(P>0.05)，與先前的研究一致，即原兒茶酸接枝殼聚糖膜的厚度也與殼聚糖膜的厚度相似[6]，酚酸接枝共聚并不能改變殼聚糖膜的厚度[5]。

當膜具有阻隔紫外線和可見光的特性時可以保護包裝食品免受光輻射。與殼聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜表現出更高的不透明度(表2)。CA-g-CS膜的不透明度最高，為(1.47±0.11)，其次是FA-g-CS膜和PA-g-CS膜。可能是由于酚酸具有可以吸收光的芳香基團[17]，不透明度的差異與接枝酚酸的種類有關[11]。

膜的水分含量對膜在潮濕環境中的耐水性有明顯的影響，因此，它是一個重要的指標。與殼聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜具有低一些的水分含量(表2)。可能是殼聚糖的官能團(—OH/—NH2)與水分子之間的氫鍵相互作用引起的，當酚酸接枝到殼聚糖膜時，氫鍵相互作用被大幅度破壞，結果也與原兒茶酸接枝殼聚糖膜的現象相似[5]。在食品包裝應用中，膜的防水性是一項至關重要的能力，這與膜的水溶性相關。與殼聚糖膜相比，酚酸-g-CS膜顯示出更高的水溶性(表2)(P<0.05)。可能是酚酸-g-CS分子間氫鍵的數量減少所致[6]。此外，HU等[13]也注意到了類似的現象和研究結果。CA-g-CS膜的含水量最低，同時其水溶性也最低。這種現象可能與咖啡酸中的官能團(—OH)有關。

WP是膜最重要的特性之一，因為暴露在外面的食物和周圍環境之間會發生水分轉移，而膜會阻礙這種轉移。如表2所示，酚酸-g-CS膜顯示出比殼聚糖膜更低的WP。這可能與殼聚糖擁有的官能團有關，這些官能團可以為水分子提供結合位點。然而，在酚酸接枝殼聚糖中，殼聚糖的親水結構的可用性極為有限，因此，羥基苯甲酸接枝殼聚糖膜對水的親和力降低[9]。研究表明，將水楊酸接枝到殼聚糖膜上也可以降低殼聚糖膜的WP[18]。CA-g-CS膜的WP低于其他殼聚糖膜的WP，這可能與CA的二羥基結構密切相關，可能因為CA接枝到CS后，酚酸上的羥基與CS之間產生相互作用，阻礙了水分子通過膜。根據WANG等[4]的研究，與其他膜相比，CA接枝殼聚糖膜顯示出較低的WP。

表2 酚酸-g-CS膜的厚度、不透明度、含水量、水溶性、水蒸氣滲透率Table 2 Thickness, opacity, moisture content, water solubility, and water apor permeability of phenolic acid-g-CS films

2.2.2 機械性能

膜的機械性能與其在食品加工和運輸過程中的抗壓能力密切相關，同時具有良好機械性能的膜可以保護食品免受損壞。由表3可知，酚酸-g-CS膜的YM、EB、TS等機械性能均高于殼聚糖膜，其中CA-g-CS膜的TS，EB和YM值最高。結果表明，酚酸提高了殼聚糖膜的機械性能。殼聚糖與酚酸的接枝過程中形成了分子間氫鍵，同時聚合物網絡之間也形成了物理連接，從而降低了膜的自由體積和分子遷移率，進而酚酸-g-CS膜具有更致密的分子結構[19]。與CS膜相比，不同羥基肉桂酸接枝殼聚糖膜的機械性能有所提高[5]。

表3 酚酸-g-CS膜的機械性能Table 3 Mechanical properties of phenolic acid-g-CS films

2.2.3 酚酸釋放量及DPPH自由基清除能力

如圖4所示，酚酸從膜中的總酚釋放量以PA-g-CS膜最高，FA-g-CS膜次之，CA-g-CS膜最低。與CS膜相比，酚酸-g-CS膜表現出更強的DPPH自由基清除能力。研究表明，在接枝沒食子酸后，CS膜的抗氧化活性也顯著增強[20]。然而，總酚釋放量最低的CA-g-CS膜表現出最好的DPPH自由基清除能力。據了解，酚羥基的數量和活性可能會影響其抗氧化能力。CASETARI等[21]的研究進一步證明，酚酸-g-CS中酚羥基的數量密切影響其抗氧化能力。因此，CA-g-CS膜DPPH自由基清除能力最強，可能取決于其二羥基結構，酚羥基在3和4位的接枝共聚物的DPPH自由基清除能力最強，因此具有3位和4位二羥基的CA-g-CS膜擁有最好的DPPH自由基清除能力[22]。

圖4 膜的抗氧化性和總酚釋放量Fig.4 Antioxidant actiity and total phenolic content of films

2.2.4 抗菌活性

研究顯示殼聚糖膜的抗菌活性在接枝酚酸后增加，所有酚酸-g-CS和CS膜的抗菌活性如表4所示。同時，與大腸桿菌相比，所有膜對金黃色葡萄球菌的抑菌活性更顯著，這可能與細菌的細胞膜結構不同有關。據報道，與革蘭氏陰性菌相比，水楊酸-g-CS膜對革蘭氏陽性菌表現出更好的抗菌活性[23]。

表4 酚酸-g-CS膜的抗菌活性Table 4 The antibacterial actiity of phenolic acid-g-CS films

在4組膜中，CA-g-CS膜對2種細菌均表現出最強的抗菌活性，這可能與CA中的2個酚羥基有關。據報道，酚羥基數量的增加會改善酚酸對微生物的抑制作用，CA-g-CS膜的抑菌能力優于其他2種膜，這主要因為CA的二羥基結構[24]。酚酸接枝后殼聚糖膜的物理性能、力學性能、生物活性均得到改善。在膜的所有性能中，CA-g-CS膜表現出最好的機械性能、抗氧化和抗菌活性。這種現象主要因為CA中的2個酚羥基。

2.3 南美白對蝦的保鮮作用

2.3.1 失重率

防止水分流失是膜產品質量的一個重要特性。在儲存過程中，蝦的失重率如圖5-a所示。無膜處理的蝦的失重率最高，采用膜處理的蝦的失重率較低。與殼聚糖膜處理的蝦相比，酚酸-g-CS膜處理的蝦具有更低的失重率，CA-g-CS膜包裹的蝦表現出最佳的失重率降低能力，與水蒸氣透過率結果一致，即膜的水蒸氣透過率和蝦的失重率之間具有相關性[21]。

2.3.2 pH值

蝦的pH值一直被用作其新鮮度的指標。當pH<7.80時，蝦的新鮮度被認為是可以接受的。由圖5-b可知南美白對蝦的pH值呈上升趨勢，對照組在貯藏期間pH值最高，尤其是第7天，pH值達到最高(7.88±0.03)，CA-g-CS膜組pH值最低(7.34±0.04)。pH值結果表明，CA-g-CS膜能有效地延緩南美白對蝦的pH值上升的速度。

2.3.3 TB-N

TB-N含量與蝦肉內的細菌和內源性酶的作用有關。海蝦的TB-N不超過30 mg/100 g是可以被接受的[5]。由圖5-c可知，所有的蝦都表現出相似的趨勢，初始TB-N約為[(3.51±0.95) mg/100 g]，而在儲存期間該值不斷上升。第5天，對照組蝦的TB-N值超過30 mg/100 g，表明蝦肉已經腐敗到讓人不可接受的程度。第7天，殼聚糖膜組的TB-N值也已經超過30 mg/100 g。同時，CA-g-CS膜組僅為[(24.19±1.31) mg/100 g]，PA-g-CS膜組和FA-g-CS膜組分別為(29.89±0.98)和(27.85±1.02) mg/100 g。結果表明，CA-g-CS膜有效地延緩了蝦肉的TB-N上升，進而表現出較好的保鮮能力。

2.3.4 TBA

TBA的值可以表示最終脂質氧化產物的濃度。如圖5-d所示，所有蝦的初始TBA值相似，約為(0.23±0.01) mg MDA/kg，而且隨著儲存時間的延長而不斷增加。第7天，對照組蝦的TBA值最高[(1.16±0.03) mg MDA/kg]，CS膜、PA-g-CS膜、FA-g-CS膜和CA-g-CS膜的TBA值分別為(0.88±0.04)、(0.76±0.02)、(0.70±0.04)和(0.62±0.03)mg MDA/kg，證實酚酸接枝殼聚糖膜有效延緩TBA上升，CA-g-CS膜的TBA值最低。

a-失重率；b-pH；c- TB-N；d- TBA；e-總菌落數；f-感官評價圖5 酚酸接枝殼聚糖保鮮南美白對蝦在儲存期間的變化Fig.5 Preseratie effect of phenolic acid-grafted-chitosan on P.annamei during storage

2.3.5 微生物分析

大多數水產品的變質和腐敗主要是由于微生物的活動，而水產品中的微生物通常與其環境中的微生物種群有關[25]。由圖5-e可知，蝦的總細菌數(total bacterial count，TBC)隨著儲存時間的延長而增加。對照組蝦的總細菌數高于所有用膜處理的蝦，對照蝦組第6天的總細菌數超過6.00 lg CFU/g，表明蝦已經過度變質。第7天，CA-g-CS膜組總細菌數最低[(5.21±0.07) lg CFU/g]，其次是PA-g-CS膜[(5.79±0.08) lg CFU/g]和FA-g- CS膜[(5.49±0.07) lg CFU/g]。綜上，酚酸接枝殼聚糖膜降低了蝦的總細菌數，這種現象可能與它們的抗菌特性有關。

2.3.6 感官評價

圖5-f展示了殼聚糖膜和酚酸接枝殼聚糖膜保鮮蝦的感官評分。所有蝦的感官評分均有所下降，而對照組的感官評分最低。對照組第6天的感官評分低于(3.8±0.2)，表明蝦肉已經腐敗到不可接受的程度。第7天對照組感官評分下降到(2.9±0.1)，而殼聚糖膜、PA-g-CS膜、FA-g-CS膜和CA-g-CS膜組的感官評分分別為(3.9±0.2)、(4.6±0.2)、(4.9±0.4)和(5.8±0.2)。CA-g-CS膜組的感官評分最高，說明它能有效延長南美白對蝦的新鮮度。

總而言之，酚酸-g-CS膜組對蝦的保鮮效果優于CS膜，同時，CA-g-CS膜對蝦的保鮮效果最好，FA-g-CS膜次之，PA-g-CS膜又次之。這可能與酚酸殼聚糖膜的抗菌和抗氧化活性有關。

3 結論

酚酸-g-CS膜的物理性能、機械性能和生物活性與接枝的酚酸息息相關。CA-g-CS膜表現出最好的性能，如機械和物理性能、抗菌和抗氧化活性，這可能取決于咖啡酸結構中的酚羥基。同時，CA-g-CS膜對蝦的保鮮效果優于其他膜。結果表明，酚酸中羥基的位置和數量對殼聚糖膜的性能有顯著影響。此外，CA-g-CS膜的實驗效果最好，表明其在食品活性包裝領域具有潛在的應用價值。