低酸牛肉發酵劑的篩選、工藝優化及品質特性研究

楊曉鋼，趙鑫銳,2,3，堵國成,2,3*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122) 3(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

發酵劑是具有特定酶活性的單獨或混合的菌株配方，肉用發酵劑是能夠在肉制品中自我繁殖的活性微生物，它們可以保持肉制品的鮮度，控制肉制品衛生安全，增強其可接受性[1]。在肉制品中添加發酵劑還具有降膽固醇、降生物胺、抗氧化等功能特性，同時可以產生促進碳水化合物、蛋白質和脂肪分解的酶類，賦予發酵肉良好風味。自然發酵肉制品存在著品質不穩定、生產易受環境制約且生產周期長等缺點。采用接種發酵劑的方法發酵牛肉，可以提高產品的品質和安全、確保產品獨特風味的形成。牛肉富含脂類、蛋白質、礦物質和B族維生素等營養成分，是人們膳食中常見的肉類品種。隨著生活質量的提高，消費者對牛肉制品的要求也越來越高，迫切需要研制營養均衡、風味獨特的中高檔牛肉制品。因此制備一款能產生良好風味、適用于發酵牛肉的發酵劑具有重要的意義。

目前歐美國家對微生物發酵肉制品的特性進行了較為深入的研究，已經完成了從傳統的自然發酵向微生物定向接種發酵的工業化生產的轉變，發酵肉制品的生產工藝已相當成熟[2]。我國發酵肉制品行業起步較晚，國內的發酵肉制品開發目前還主要停留在實驗室階段，市面產品較少。發酵劑中的乳酸菌利用碳水化合物生成的乳酸和少量的乙酸、甲酸、琥珀酸等，可在抑制腐敗菌生長同時賦予發酵肉特殊的香味[3]。葡萄球菌與肉制品色澤的形成相關，而木糖葡萄球菌能夠轉換氨基酸和游離脂肪酸，協調風味的形成[4]。酵母菌在發酵過程中能夠抑制脂肪的氧化，此外還能形成一定量的酯類和醇類改善肉制品的風味。單獨使用酵母，會使氨的含量上升，而乳酸和乙酸的含量下降，從而導致pH的上升；酵母菌與乳酸菌和微球菌聯合使用時，效果較好[5]。目前多數研究聚焦，單菌或兩菌混合發酵肉類，張蘇蘇等[6]從自然發酵酸菜汁中分離出乳酸菌，將其和漢遜德巴利酵母菌混合發酵塊狀鹿肉并研究其發酵特性。SUN等[7]在哈爾濱干腸中接種木糖葡萄球菌和植物乳桿菌，研究其對香腸的腸桿菌數、生物胺積累量和感官品質的影響。RUIZ-MOYANO等[8]將乳酸片球菌SP979和發酵乳桿菌HL57混合作為發酵劑，進行伊比利亞發酵香腸的研制。然而對于乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌3種菌組合發酵肉的研究報道較少。

在肉制品發酵過程中，微生物可以代謝亮氨酸生成3-甲基丁醛，3-甲基丁醛可以和含硫化合物反應,產生良好的風味。同時，3-甲基丁醛的閾值很低，對發酵肉制品的典型風味有重要影響，可以作為發酵劑菌種產香性狀量化的標準。本實驗從傳統發酵肉制品出發，經過發酵特性試驗初步篩選出符合要求的乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌，以產3-甲基丁醛的能力為標準復篩篩選出產香菌株。再經拮抗實驗，并以pH和游離氨基酸含量為標準確定最優的菌種組合以及其比例。經過單因素試驗確定優化范圍，以pH和感官評分為標準運用響應面法優化發酵工藝。隨后，將本實驗研制的發酵劑與商業發酵劑進行對比，探討與商業發酵劑發酵的肉制品在pH、色差、游離氨基酸含量、質構和風味等方面的差異，以期為我國優良發酵劑的制備和研發提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

各種來源的中國傳統發酵肉制品如宣威火腿、金華火腿、皇上皇臘腸、松桂坊臘魚、如皋火腿、四川臘腸、哈爾濱紅腸、湖南煙熏臘肉、貴州酸渣肉等十余種樣品，市售。商業發酵劑WBX-43、THM-17、BM-60和BM-101，上海昊岳有限公司。

1.2 培養基

MRS培養基、氨基酸脫羧酶培養基、葡萄糖產氣培養基、產H2S培養基、產氨培養基、H2O2產生檢測培養基、硝酸鹽還原培養基、糖發酵培養基、MSA培養基、發酵葡萄糖產氣培養基、硝酸鹽還原酶培養基、精氨酸產氨培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基、生長培養基、DNA酶培養基、YPD培養基等培養基配制參考王永霞[9]的方法,TTC上層培養基和TTC下層培養基配制參考許艷豐等[10]的方法。

1.3 儀器與設備

電子天平，奧豪斯儀器有限公司；可見分光光度計，島津儀器有限公司；顯微鏡，上海永亨光學儀器制造有限公司；SW-CJ-2G型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HG303-4型電熱恒溫培養箱，南京試驗儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳酸菌初步篩選

1.4.1.1 樣品處理

在無菌環境下準確稱取各樣品10 g，剪碎后將各樣品分別轉入90 mL無菌蛋白胨水中，于搖床振蕩混勻(220 r/min，1 h)，隨后靜置5 min。取1 mL上清液接種于MRS液體培養基，37 ℃培養24 h。以2%(體積分數，下同)接種量接種到MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h。用無菌生理鹽水將培養液稀釋成不同倍數的菌懸液，分別吸取0.2 mL菌懸液均勻涂布于MRS鑒別培養基，37 ℃培養48 h，挑取變為黃色的單菌落，隨后將單菌落在MRS固體培養基上劃線分離純化2次，得到純菌落。將篩選出來的菌株進行革蘭氏染色和鏡檢，將革蘭氏陽性的菌株進行16S rRNA測定，篩選出乳酸菌。將篩選出的乳酸菌接種到MRS固體試管斜面，于4 ℃保藏。

1.4.1.2 乳酸菌發酵特性試驗

將篩選得到的乳酸菌進行產黏性試驗、產H2O2試驗、產氨試驗、葡萄糖產氣試驗、產H2S試驗、硝酸鹽還原能力試驗、氨基酸脫羧酶實驗、耐鹽性實驗和耐亞硝酸鹽實驗，參考盧士玲[11]的方法進行實驗。

1.4.2 葡萄球菌初步篩選

1.4.2.1 樣品處理

在無菌環境下準確稱取各樣品10 g，剪碎后將各樣品分別轉入90 mL無菌蛋白胨水中，于搖床振蕩混勻(220 r/min，1 h)，隨后靜置5 min。取1 mL上清液接種于MSA液體培養基，37 ℃培養24 h。以2%接種量接種到MSA液體培養基中，37 ℃培養24 h。用無菌生理鹽水將培養液稀釋成不同倍數的菌懸液，均勻涂布于MSA固體培養基上，篩選出單菌落。隨后將單菌落在MSA固體培養基上劃線分離純化2次，得到純菌落。將篩選出來的菌株進行革蘭氏染色和鏡檢，將革蘭氏陽性的菌株進行16S rRNA測定，篩選出葡萄球菌。將篩選出的葡萄球菌接種到MSA固體試管斜面，于4 ℃保藏。

1.4.2.2 葡萄球菌發酵特性試驗

將篩選得到的菌株進行過氧化氫酶檢測、凝固酶檢測、脫氧核糖核酸酶檢測、硝酸還原酶檢測、發酵葡萄糖產氣實驗、產H2S試驗、分解精氨酸檢測、氨基酸脫羧酶、蛋白酶活性測定和脂肪酶活性測定實驗檢測，參考劉艷霞[12]的方法進行實驗。

1.4.3 酵母菌初步篩選

1.4.3.1 樣品處理

取各樣品10 g于無菌下剪碎，將樣品加入YPD液體培養基中，加入鏈霉素和四環素鹽酸鹽至終質量濃度為25 mg/L，于220 r/min 搖床，30 ℃培養24 h后，取1 mL培養液上清液，用無菌生理鹽水稀釋成不同的倍數，涂布于YPD固體平板培養基上于30 ℃靜置培養24 h，挑取單菌落。隨后將單菌落在YPD固體培養基上劃線分離純化2次，得到純菌落。

1.4.3.2 酵母菌發酵特性試驗

將篩選的菌株進行產酒精能力測定、耐鹽性試驗、耐亞硝酸鹽試驗、產香能力試驗測定，參照張鵬[13]的方法進行實驗。

1.4.4 初篩菌株產3-甲基丁醛能力的復篩[14]

1.4.4.1 活化培養

將菌株于液體培養基中35 ℃活化2次，然后按2%的接種量接種到100 mL培養基中，35 ℃下培養24 h，4 ℃、10 000 r/min離心10 min收集菌體，將菌體重懸于無菌生理鹽水中，再次離心。重復操作1次，以洗去殘余培養基。所獲菌體于-20 ℃貯藏下備用。

1.4.4.2 3-甲基丁醛的生成

在已滅菌固相微萃取樣品瓶中加入0.5 mL待測菌液，3 mL含有2 mmol/L亮氨酸、2 mmol/L 5′-磷酸吡哆醛、10 mmol/L α-酮戊二酸、0.067 mol/L已滅菌磷酸緩沖液(pH 6.5)，反應體系共3.5 mL；對照組加入0.5 mL無菌生理鹽水。35 ℃培養24 h。

1.4.4.3 3-甲基丁醛的提取

在室溫下用萃取纖維頭[羧基-聚二甲基硅氧烷(carboxen-polydimethylsiloxane, CAR-PDMS)]在固相微萃取樣品瓶中頂空萃取15 min，隨后在氣譜上解吸10 min。色譜條件：載氣N2，流量1.4 mL/min；毛細管色譜柱DB-1701(30 m×0.32 mm×1 μm)；柱箱溫度：維持38 ℃的溫度2 min，然后以3 ℃/min升溫到90 ℃，然后以10 ℃/min升溫到220 ℃，隨后保持3 min。檢測器：氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector，FID);溫度275 ℃。

1.4.4.4 3-甲基丁醛的鑒定和定量測定

根據3-甲基丁醛標品的保留時間來定性，根據峰面積來定量。

1.4.5 菌種拮抗實驗

將復篩篩選出的3株菌用接種環挑取單菌落，不同菌株間兩兩依次交叉劃線于MRS固體培養基平板上進行拮抗試驗。35 ℃培養48 h，待長出菌落后，觀察菌株劃線的交叉處是否生長菌落。如試驗菌落不能在交叉處生長，說明菌間有拮抗作用；反之則無拮抗作用，可用于發酵。

1.4.6 發酵牛肉工藝流程

參考李疆[15]的方法并稍作修改，選用檢驗合格的牛里脊肉，剔除筋膜和脂肪后，切成500 g左右的小塊，立即浸入準備好的涼水中，除去殘余血液，大約浸泡1 h左右，中間換水2次。浸泡后瀝干，漂煮10 min，漂煮后的牛肉經切塊(順纖維，20 g，5 cm×2 cm×1.5 cm)、發酵(注射)、烘烤(55～60 ℃，3～4 h)、殺菌(115 ℃滅菌，30 min)，冷卻至室溫將牛肉進行真空包裝即為成品。牛肉處理過程中不添加任何調味料。

1.4.7 發酵牛肉品質特性檢測

pH測定參照 GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》；游離氨基酸測定采用茚三酮比色法；感官評定參照龐國強[16]的方法；色差和質構檢測參照付麗等[17]的方法；揮發性風味化合物檢測參照周亞軍等[18]的方法。

1.4.8 單因素試驗設計

1.4.8.1 最適發酵組合確定

選擇35 ℃為發酵溫度，發酵時間48 h，接種量107CFU/g，菌種比例1∶1∶1，以pH和游離氨基酸含量為標準篩選出發酵劑最優菌種組合。

1.4.8.2 發酵組合最適發酵比例確定

選擇35 ℃為發酵溫度，發酵時間48 h，接種量107CFU/g，將最優發酵劑組合按著不同發酵劑菌種比例(1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、1∶2∶2、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1)進行發酵，以pH和游離氨基酸含量為標準篩選出發酵劑最佳菌種組合的最佳菌種配比。

1.4.8.3 響應面優化工藝范圍確定

以pH和游離氨基酸含量為評價標準，確定發酵溫度、發酵時間和接種量響應面優化的條件范圍選擇。將各實驗研究因素定為變量，其他因素固定不變。不變因素為發酵溫度35 ℃、接種量107CFU/g，發酵時間48 h，發酵劑菌種配比植物乳桿菌LM34∶肉葡萄球菌SAB18∶異常威克漢姆酵母YE3為2∶1∶1。

1.4.9 響應面法優化發酵工藝

為確定最優發酵工藝水平,在單因素實驗的基礎上,對發酵溫度、發酵時間、接種量三因素進行優化組合，以pH和感官評分為響應值采用三因素三水平Box-Behnken試驗優化發酵工藝參數，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken實驗設計，其編碼水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因素與水平Table 1 Factors and leels used in Box-Behnken design

1.4.10 與商業發酵劑發酵制品品質對比

將本實驗篩選出的菌種按照最佳比例配制成發酵劑，發酵劑命名為FBS-55。將此發酵劑與4種商業發酵劑WBX-43、THM-17、BM-60和BM-101在響應面優化的發酵條件下共同發酵牛肉樣品，分析比較FBS-55與商業發酵劑發酵的樣品在pH、色差、游離氨基酸含量、質構和揮發性風味化合物差異。

2 結果與分析

2.1 發酵劑菌株篩選

2.1.1 發酵特性實驗

從樣品中共篩選出乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌各270株。經一系列發酵特性試驗(表2)共篩選出符合全部發酵特性試驗要求的菌株，其中乳酸菌21株，葡萄球菌9株，酵母菌12株。經16S rRNA菌株鑒定后，21株乳酸菌中15株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，6株為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)；9株葡萄球菌皆為肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)；12株酵母菌中，5株為近平滑假絲酵母(Candidametapsilosis)，7株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。其中植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和肉葡萄球菌為一般認為安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)的食品級菌株，異常威克漢姆酵母可用于酸面團的發酵[19]，而近平滑假絲酵母為非食品級菌株，因此僅選擇除近平滑假絲酵母外的37株菌用于低酸牛肉發酵劑的篩選。

表2 分離菌株主要發酵特性Table 2 The main fermentation characteristics of the isolates

2.1.2 產3-甲基丁醛實驗結果

對發酵特性實驗所篩選得到的菌株產風味物質3-甲基丁醛的能力的大小進行檢測。由表3可知，葡萄球菌產3-甲基丁醛能力較強，乳酸菌和酵母菌產3-甲基丁醛能力較差，這與王海燕等[14]的研究結果一致。挑選出3-甲基丁醛產量最高的乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌各3株，分別為植物乳桿菌LRS3、LRS50和LM34；肉葡萄球菌SAB18、SAB113和SAB25；異常威克漢姆酵母YE3、YE10和YE15。

表3 不同菌株的3-甲基丁醛產量Table 3 Production of 3-methyl-butanal by different strains

2.1.3 拮抗實驗

將3種菌兩兩交叉劃線涂布培養，共27個組合每組3個平行。當2種菌的相交處沒有出現抑菌圈，說明2種菌之間不存在拮抗作用。統計結果可知，27個組合之間均未出現抑菌圈，3種菌株兩兩之間不存在拮抗作用，可用于發酵劑配制。

2.1.4 最佳菌種組合確定

不同組合發酵牛肉的pH和游離氨基酸含量見表4。游離氨基酸含量最高的3組為第5組、第19組和第21組，其游離氨基酸均>1 000 mg/kg，其中第19組的游離氨基酸含量最高，為1 174.44 mg/kg。傳統上認為低酸牛肉pH≥5.50，低酸發酵在風味、營養方面都優于高酸發酵，而且從我國消費習慣來看，低酸發酵肉制品更具有市場競爭力。而pH>5.90時腐敗菌會生長，導致牛肉腐敗[15]。3組中，第5組pH為6.00，第19組pH為5.53，第21組pH為5.77。第19組最接近低酸發酵牛肉的酸度標準且游離氨基酸含量最高，故選擇第19組即植物乳桿菌LM34、肉葡萄球菌SAB18和異常威克漢姆酵母YE3作為發酵劑菌種組合。

表4 不同菌種組合發酵牛肉的pH和游離氨基酸含量Table 4 pH and free amino acid contents of the different combination of strains

2.2 工藝條件優化

2.2.1 最佳配比確定

由圖1可知游離氨基酸含量最高的2組菌種配比是植物乳桿菌LM34∶肉葡萄球菌SAB18∶異常威克漢姆酵母YE3為2∶1∶1和1∶1∶2，其他組游離氨基酸含量差別不大。但由于1∶1∶2組的pH值為5.93>5.90，可能會導致腐敗菌生長。2∶1∶1組的pH為5.43，符合低酸牛肉標準，更適合國人口感且能抑制腐敗菌生長。選擇發酵劑菌種比例為植物乳桿菌LM34∶肉葡萄球菌SAB18∶異常威克漢姆酵母YE3 2∶1∶1。

圖1 發酵劑配比對牛肉pH及游離氨基酸含量的影響Fig.1 Effect of mixed starter cultures on pH and free amino acid content of fermented beef

2.2.2 發酵時間的選擇

由圖2可知，隨著發酵時間的延長，乳酸菌大量繁殖，牛肉干pH逐漸降低，游離氨基酸含量顯著提高。在發酵時間12～36 h，pH值急速下降，36 h時達到5.60，能夠抑制腐敗菌生長。在36 h后pH值降低速度變緩，在48 h達到5.47，符合低酸牛肉發酵標準。在48 h后pH值繼續下降，到達發酵終點時pH值為5.27，可能會造成口感過酸。綜合考慮，發酵時間選擇18(pH 6.37)～66 h(pH 5.29)。

圖2 發酵時間對牛肉pH和游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on pH and free amino acid content of fermented beef

2.2.3 發酵溫度的選擇

由圖3-a可知，隨著發酵溫度的升高，發酵牛肉的產酸速率增大。其中22 ℃組pH下降速率較小，到發酵終點時pH值為6.03，無法抑制腐敗菌生長。26 ℃組在12～36 h發酵產酸速率比22 ℃組高，但明顯低于其他3組。產生這樣變化的原因可能是乳酸菌低溫產酸能力小于高溫產酸能力[20]。30、34和38 ℃發酵在12 h之前pH下降速率不大，在12 h后迅速下降，在36 h后下降速率又開始變慢，最終34和38 ℃ 2組發酵終點pH相近，均為5.10左右。由圖3-b可知,隨著發酵時間延長，5組游離氨基酸含量都增加，在48 h前38 ℃組的游離氨基酸含量低于34 ℃組，隨后38 ℃組的游離氨基酸含量慢慢超過34 ℃組，在發酵終點時，發酵溫度越高，游離氨基酸含量越高。綜上，發酵溫度優化范圍選擇26～38 ℃較為適宜。

a-pH；b-游離氨基酸含量圖3 發酵溫度對牛肉pH和游離氨基酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on pH and free amino acid content of fermented beef

2.2.4 菌種接種量的選擇

由于乳酸菌分解碳水化合物生成乳酸，由圖4-a可知，隨著乳酸菌的接種量增大，乳酸的產量增加，pH逐漸降低。接種量為104和105CFU/g時，發酵終點的pH分別為6.43和6.18，無法抑制腐敗菌生長。由圖4-b可知，隨接種量增加和發酵時間延長，牛肉中游離氨基酸含量逐漸增加。這與CANDOGAN等[21]的研究一致。因此接種量選擇106～108CFU/g較為適宜。

a-pH；b-游離氨基酸含量圖4 接種量對發酵牛肉pH和游離氨基酸含量的影響Fig.4 Effect of inoculum size on pH and free amino acid content on fermented beef

2.3 響應面優化發酵工藝

2.3.1 Box-Behnken試驗設計及結果

Box-Behnken試驗設計及結果見表5。試驗共17個試驗點(零點5個、析因點12個)，A、B、C三因素所構成三維頂點為自變量值。pH值和感官評分為響應值，所得數據由Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析。

表5 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 5 Box-Behnken design and results

2.3.2 響應面優化結果分析

pH響應面模型F值為19.31、P為0.000 4，失擬項F為3.52、P為0.127 8>0.05，變異系數為2.21%；感官評分響應面模型F值為27.63、P為0.000 1，失擬項F為3.63、P為0.122 5>0.05，變異系數為0.89%。2個實驗模型回歸極顯著，失擬合相對于純誤差不顯著、模型建立有效，試驗精密度及可靠性較高。由圖5可知對pH值影響的因素由大到小為：接種量>發酵溫度>發酵時間；對感官評分影響的各因素從大到小依次為：發酵溫度>接種量>發酵時間(圖6)。在Design-Expert 8.0.6軟件中，Optimization設定感官評價為Maximize，pH為5.40～5.70，得到的最優發酵條件組合是發酵溫度35.87 ℃，發酵時間48.18 h，接種量1.32×107CFU/g。其pH預測值為5.43，感官評價得分預測值為89.33。經發酵驗證試驗后測得發酵牛肉干pH值為5.48，感官評價得分為87.67，得分與預測值相近，表明本研究確定的工藝可行度高，發酵劑可用于牛肉的發酵，將此發酵劑命名為FBS-55。

a-發酵溫度和發酵時間；b-發酵溫度和接種量；c-發酵時間和接種量圖5 各因素對牛肉pH影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect fermentation conditions on the pH of fermented beef

a-發酵溫度和發酵時間；b-發酵溫度和接種量；c-發酵時間和接種量圖6 各因素對牛肉感官評分影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of fermentation conditions on the sensory ealuation score of fermented beef

2.4 與商業發酵劑發酵制品品質對比

2.4.1 pH對比

由圖7可知BM-60和THM-17兩組發酵劑發酵牛肉所得的牛肉pH值相近，分別為5.25和5.27，FBS-55和BM-101兩組發酵劑發酵牛肉所得pH值相近分別為5.51和5.56，WBX-43發酵牛肉pH最低為5.04。5組發酵劑均能抑制腐敗菌生長，但發酵劑WBX-43發酵的牛肉由于pH過低，可能會造成口感偏酸。最符合低酸牛肉的標準的兩組是發酵劑FBS-55和發酵劑BM-101。

圖7 不同發酵劑的發酵牛肉pHFig.7 pH of fermented beef with different starters

2.4.2 色澤對比

由表6可知THM-17、BM-101和FBS-55三組發酵劑的樣品L*差別不顯著(P<0.05)，WBX-43組L*明顯低于BM-60。FBS-55的樣品紅度值a*明顯高于其他組發酵劑，WBX-43和FBS-55組的黃度b*小于其他組，其余3組差別不大。在發酵牛肉干制作過程中，對色澤影響最關鍵的是紅度值a*，但黃度值b*和亮度值L*對其也有一定的影響[22]。因此參考段艷[23]的方法引入影響參數E值作為衡量、評價牛肉色的主要參數。由表6可知FBS-55的E值高于其余發酵劑組。綜合以上結果，在發酵牛肉干整個制作過程中，FBS-55發酵劑組的紅度值a*和E值顯著高于其他3組(P<0.05)。說明添加FBS-55發酵劑可以有效地改善發酵牛肉干的色澤，使其顏色更鮮艷，更易吸引消費者。

表6 不同發酵劑發酵牛肉色度Table 6 Chroma of fermented beef by different starters

2.4.3 游離氨基酸含量差異

如圖8所示，5組發酵劑中游離氨基酸含量最高的是FBS-55，BM-60游離氨基酸含量最低，其余3組游離氨基酸含量差別不大(P<0.05)。游離氨基酸的含量直接影響著發酵牛肉干風味物質的形成[24]。因此采用FBS-55發酵牛肉，可能會產生更好的風味。

圖8 不同發酵劑發酵牛肉游離氨基酸含量Fig.8 Free amino acid contents of fermented beef by different starters

2.4.4 發酵牛肉質構特性分析

在質地屬性中，硬度對消費者來說是最重要的，它決定了肉類的商業價值[25]。由表7可知，BM-60組樣品的硬度最高，THM-17組樣品硬度最低，WBX-43、BM-101和FBS-55三組樣品的硬度適宜[26]。造成發酵肉樣硬度和咀嚼度不同的原因是發酵時菌種的蛋白酶作用不同，蛋白酶含量在發酵過程中增強，促使牛肉中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白分解，破壞樣品內部結合力，降低硬度和咀嚼性。THM-14和BM-101兩組發酵肉黏性過大，可能會造成不良口感。5組發酵肉樣的彈性之間差別不大。

表7 不同發酵劑發酵牛肉質構參數Table 7 Texture parameters of fermented beef by different starters

2.4.5 揮發性風味物質

分離出的揮發性化合物主要以醛類和醇類化合物為主，碳氫化合物的香味閾值較高，對肉品香味形成直接貢獻不大。醛類是最重要的揮發性化合物，其風味閾值較低。己醛、壬醛、癸醛等直鏈醛類主要是脂肪氧化降解產生的，這說明接種復合發酵劑在一定程度上促進了牛肉蛋白質和脂質氧化[18]。由表8可知，其中5組發酵劑醛類相對含量最多的是WBX-43，其中壬醛含量遠高于其他組。壬醛為油酸的氧化之后的產物，具有油脂的清新味，是燒制類牛肉中常見的風味物質[27]。FBS-55組是5組中唯一含有3-甲基丁醛的樣品，相對含量為2.26%。3-甲基丁醛來源于亮氨酸，與風味密切相關。此外在高濃度的酸和醇存在以及微生物酯酶活力低的情況下，它們能夠進一步轉化成芳香的酯類物質改善產品風味。

表8 不同發酵劑發酵牛肉主要揮發性風味物質種類及相對含量Table 8 Types and relatie contents of olatile flaor substances in fermented beef by different starters

3-甲基-1-丁醇風味閾值較低，是熟肉制品中重要的香氣成分。5組發酵劑中FBS-55和THM-17發酵樣品中檢出3-甲基-1-丁醇，其含量分別為2.90%和0.30%。1-辛烯-3-醇被認為是產生香氣的重要因素，具有蘑菇般的氣味[28]，FBS-55發酵樣品中1-辛烯-3-醇含量較高，為6.03%。醇類中乙醇是多數酯類風味物質的合成底物，對醬類制品風味的形成起到間接重要影響。乙醇，有的被氧化生成有機酸，有的和氨基酸或有機酸等生成醋，有的部分揮發或殘留在醬膠中，對發酵型醬制品的香味構成有重要的作用[29]。5組發酵中只有FBS-55組樣品中檢出乙醇，含量為5.11%。

吡嗪類物質是美拉德反應的中間產物，具有濃郁的烤肉香氣，5組發酵劑中FBS-55和BM-101發酵樣品吡嗪相對含量較高，分別為3.52%和3.01%。適量的有機酸可提高醬制品的香味和口感，除了本身呈味之外，有機酸參與酯化反應，形成酯香風味[30]。由表8可知WBX-43發酵的牛肉中含有10種酸類，相對含量為35.62%。乙酸含量為7.01%，遠高于其余4組，有機酸含量過高，可能會造成不良風味。

綜上所述，自主研發發酵劑FBS-55發酵的肉制品中含有3-甲基丁醛，能夠產生良好風味，有機酸含量適量，有助于提高牛肉口感，同時含有熟肉肉制品中重要的香氣物質3-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇。此外還含有乙醇，可以使肉制品產生良好的醬香。

3 結論

從我國傳統發酵肉制品中篩選出3種菌，經過發酵特性實驗的初篩和產3-甲基丁醛能力的復篩篩選出植物乳桿菌、肉葡萄球菌和異常威克漢姆酵母各3株。經過拮抗實驗和最佳組合篩選實驗篩選出植物乳桿菌LM34、肉葡萄球菌SAB18和異常威克漢姆酵母YE3作為發酵劑菌種。以pH和游離氨基酸為評價指標進行一系列的單因素試驗，確定發酵劑菌種配比為2∶1∶1，發酵條件優化的選擇范圍為：發酵溫度26～38 ℃、發酵時間18～66 h和接種量106～108CFU/g。以pH和感官評分為響應值采用三因素三水平Box-Behnken試驗優化發酵工藝參數，優化后的參數為發酵溫度35.87 ℃，發酵時間48.18 h，接種量1.32×107CFU/g。其pH預測值為5.43，感官評價得分預測值為89.33。經發酵驗證試驗后測得發酵牛肉干pH值為5.48，感官評價得分為87.67。

將本實驗研制發酵劑FBS-55與4種商業發酵劑進行pH、游離氨基酸含量、質構、色差和風味物質的對比。自制發酵劑發酵的牛肉樣品pH值適宜符合低酸牛肉標準，游離氨基酸含量較高，口感優良、軟硬適中，色澤較好，同時具有良好的風味，可用于低酸牛肉的發酵。