產酶溶桿菌L-43合成抗菌肽的發酵工藝優化

封成玲，劉洋，賈紫偉，劉丹丹，李清向，寧亞維，王志新

(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050018)

目前在植物病害的防治中，化學防治仍處于主要地位，但長期使用化學農藥不僅會造成環境污染、土壤結構破壞、抗藥性病害菌增多等后果，也會對人畜的健康造成危害[1]。生物防治具有成本低、見效快、環保健康、不易產生耐藥菌等優點[2]，是目前替代化學防治或減少化學農藥用量的有效手段。研究者已經從土壤、種子等材料中開發出多種生防菌[3]，并將其應用于人參[4]、檳榔芋[5]、馬鈴薯[6]等多種植物病害的防治，同時，在食品防腐[7]等領域亦有應用。這些生防菌主要有芽孢桿菌、鏈霉菌、枯草桿菌、側單胞菌等。研究報道顯示，雖然已經有大量的生防菌被開發，但由于菌株的篩選多處于實驗室環境，導致在應用中仍存在菌株不穩定、抑菌活性弱等不足，因此開發新型、優良的菌株，已成為生防菌研究亟需解決的問題。溶桿菌是一類新興的生防菌，對多種微生物如真菌、卵菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等均具有很高的拮抗作用，應用前景廣泛[8]。

產酶溶桿菌屬于溶桿菌屬，是極具生防潛力的一類菌株，主要通過分泌多種胞外酶與小分子次生代謝物起生物防治作用，包括蛋白酶、磷酸酶、幾丁質酶、纖維素酶、β-1,3-葡聚糖酶、熱穩定性抗真菌因子(heat-stable antifungal factor, HSAF)、脂肽類化合物等。產酶溶桿菌分泌的α-蛋白酶可以降解線蟲體壁的蛋白質[9]；磷酸酶能夠有效降解病原菌胞膜中的磷脂，導致菌體細胞破滅[10-11]；幾丁質酶可以降解病原微生物細胞壁中的幾丁質而發揮作用[12]；纖維素酶能夠作用于卵菌的細胞壁，破壞卵菌的結構；β-1,3-葡聚糖酶作用于病原真菌細胞壁，抑制菌體的生長[13]。多種酶類協同作用，加強了產酶溶桿菌的拮抗作用。HSAF是一類大環內酰胺類化合物，對絲狀真菌與卵菌有很強的抑制作用。此外，HSAF熱穩定性高，可以靶向作用于絲狀真菌鞘脂的生物合成[14-15]，且對植物與哺乳類動物不產生危害。目前報道的脂肽類化合物WAP-8294有WAP-8294A1、WAP-8294A2、WAP-8294A3幾種結構，其對革蘭氏陽性菌具有較強的拮抗作用，但熱穩定性不高[16]。KATO等[17]對WAP-8294A2進行了臨床試驗，將其作用于由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的小鼠系統性感染，發現其藥效是萬古霉素的14倍。此外，產酶溶桿菌產生的表面活性物質[18]，也可以防治植物病害。

產酶溶桿菌分泌的多種酶類與次生代謝物相互協同作用，使產酶溶桿菌具有廣譜的抑菌性，在食品、農業與醫學等方面具有廣泛的應用價值。本課題組前期從土壤中分離并鑒定出1株產酶溶桿菌L-43，經研究發現其代謝物對革蘭氏陽性菌和部分真菌均具有很強的抑制性，對其抑菌物質進行鑒定發現其為小分子肽類化合物，且與WAP-8294不同，其熱穩定性較好，具有研究應用價值，有望開發為生物防菌劑。前期研究發現，僅用常規的牛肉膏蛋白胨培養基進行菌株培養時，菌株并不能有效合成抗菌肽，抑菌活性低，因此，尋求抗菌肽高效合成且成本低廉的培養基十分必要，這也是實現規模生產的基礎。

目前，國內外對溶桿菌屬的發酵優化研究還較少。2008年，王云霞等[19]采用單因素與正交試驗對產酶溶桿菌OH11的搖瓶發酵條件進行了優化，優化后培養基中活菌數明顯高于原基礎培養基中的活菌數。2011年，田囡[20]對產酶溶桿菌OH11產HSAF的培養基進行了優化，優化后的HSAF產量比優化前提高了25%～30%。2012年，李寧等[21]利用響應面法對溶桿菌UCo1產溶菌酶的培養基進行了優化，將溶菌酶活力提高了11.93%。2015年，應晨等[22]在LB液體培養基的基礎上，采用正交試驗對產酶溶桿菌R-2-1的發酵培養基與發酵條件進行了優化，優化后培養基中的活菌數與發酵代謝物產量得到了有效提高。2018年，TANG等[23]對產酶溶桿菌OH11發酵HSAF的培養基進行了優化，以價格低廉的大豆粉、葡萄糖、CaCl2作為營養成分，HSAF的合成量提高了近12倍。本研究以實驗室分離獲得的產酶溶桿菌L-43作為實驗菌株，利用價格低廉的碳源、氮源與無機鹽對產酶溶桿菌合成抗菌肽的發酵培養基進行了優化，降低了發酵成本，并在此基礎上，對發酵時間等6個發酵條件進一步優化，以期為產酶溶桿菌L-43抗菌肽的規模化發酵生產，以及抗菌肽的性質、合成途徑與應用等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

產酶溶桿菌(Lysobacterenzymogenes)L-43由本實驗室前期從土壤中分離并保藏。抑菌性測定指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)ATCC 25923，由河北科技大學酶工程實驗室保藏。

1.1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基(NB，g/L)：蛋白胨10.0、牛肉膏3.0、NaCl 5.0；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA，g/L)：蛋白胨10.0、牛肉膏3.0、NaCl 5.0、瓊脂18.0，pH 7.2～7.4，上述培養基均于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1L.enzymogenesL-43生長曲線測定

將L.enzymogenesL-43接種至NB培養基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h時取樣并用生理鹽水進行適當稀釋后，涂布于NA固體培養基上，37 ℃倒置培養24 h進行菌落計數。

1.2.2L.enzymogenesL-43種子液制備

將L.enzymogenesL-43接種至NB培養基中，37 ℃，200 r/min條件下培養24 h后，以2.0%(體積分數)接種量接種至NB培養基中，37 ℃，200 r/min培養10 h至二代對數生長期。將二代種子液以2.0%(體積分數)接種量接種至發酵培養基進行搖瓶發酵。

1.2.3 抗菌肽效價測定

選用牛津杯瓊脂擴散法測定效價。選用金黃色葡萄球菌為指示菌，參照張鳳嬌[24]的方法進行發酵上清液效價測定。

1.2.4 培養基的碳源優化

向NB培養基中，分別添加10.0 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、殼聚糖、甘露醇、可溶性淀粉和液糖，以NB培養基為對照，篩選出最優碳源。分別向NB培養基中添加5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0 g/L的最優碳源，優化碳源添加量。

1.2.5 培養基的氮源優化

以10.0 g/L麥芽糖為碳源，5.0 g/L NaCl為無機鹽，分別以10.0 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、玉米漿粉、魚蛋白胨和尿素作為氮源，以不添加氮源的培養基作為對照，篩選最優氮源。分別向培養基中添加5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0 g/L的最優氮源，優化其添加量。

1.2.6 培養基無機鹽優化

以10.0 g/L麥芽糖作為碳源、10.0 g/L胰蛋白胨作為氮源，分別以1.0 g/L的NaCl、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、FeCl3、Fe2(SO4)3、ZnSO4、CuSO4和MnSO4作為無機鹽，以不添加無機鹽的培養基作為對照，篩選出最優無機鹽。設置最優無機鹽添加量為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L，進一步優化無機鹽添加量。

1.2.7 培養基表面活性劑優化

以10.0 g/L麥芽糖為碳源，10.0 g/L胰蛋白胨為氮源，1.0 g/L MgSO4為無機鹽，分別添加0.5%(體積分數)的吐溫-80和吐溫-20作為表面活性劑，以不添加表面活性劑的培養基作為對照，篩選出最優表面活性劑。設置最優表面活性劑添加量(體積分數)為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，優化表面活性劑添加量。

1.2.8 發酵培養基的正交試驗

以1.2.4～1.2.7篩選出的最佳碳源(麥芽糖)、氮源(胰蛋白胨)、無機鹽(MgSO4)為因素，分別設置3個水平，采用L9(33)正交試驗，因素與水平如表1所示，進行搖瓶發酵，篩選出最優發酵培養基組合。

表1 發酵培養基成分正交試驗因素與水平Table 1 Factors and leels of orthogonal experiment of fermentation medium

1.2.9 發酵培養基初始pH優化

其他條件不變，調整發酵培養基初始pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，進行搖瓶發酵，測定其效價，篩選出最佳初始pH。

1.2.10 發酵溫度優化

其他條件不變，分別設置發酵溫度為28、30、32、34、36 ℃，進行搖瓶發酵，測定其效價，篩選出最佳發酵溫度。

1.2.11 發酵時間優化

其他條件不變，分別測定發酵液16、20、22、24、30、36、48、60、72 h時的效價，確定最佳發酵時間。

1.2.12 接種量優化

其他條件不變，分別設置種子液接種量為(體積分數)：1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，進行搖瓶發酵，測定其效價，確定最佳接種量。

1.2.13 發酵溶氧量優化

其他條件不變，分別設定搖床轉速為180、200、220、240、260 r/min進行搖瓶發酵，測定其效價，確定最佳搖瓶發酵轉速；分別設定250 mL三角瓶中，裝液量為30、40、50、60、70、80 mL，進行搖瓶發酵，測定其效價，確定最佳裝液量。

1.2.14 發酵條件的正交試驗

以1.2.9～1.2.13篩選出的初始pH、裝液量、接種量與發酵時間為因素，分別設置4個水平，進行L16(44)的正交試驗，水平與因素如表2所示，進行搖瓶發酵，篩選出最優發酵條件組合。

表2 發酵條件正交試驗因素與水平Table 2 Factors and leels of orthogonal experiment of fermentation conditions

2 結果與分析

2.1 L.enzymogenes L-43生長曲線

根據L.enzymogenesL-43在24 h內的菌體生長情況，繪制其生長曲線(如圖1所示)。L.enzymogenesL-43在NB培養基中生長的遲緩期在0～4 h內，對數生長期在4～12 h內，穩定期在12～24 h內。

圖1 L.enzymogenes L-43的生長曲線Fig.1 The growth cure of L.enzymogenes L-43

2.2 培養基碳源優化

對于一切異源微生物，碳源又兼做能源，是菌體生長存活必不可少的營養物質之一，不同的碳源會對菌體的生長代謝產生不同的影響。本研究選用10種碳源，探究其對抗菌肽合成的影響，結果如圖2所示。

1-空白CK組；2-果糖；3-蔗糖；4-麥芽糖；5-葡萄糖； 6-殼聚糖；7-乳糖；8-淀粉；9-甘露醇；10-液糖；11-糊精圖2 碳源對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.2 Effect of different carbons on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

相比于果糖、葡萄糖，麥芽糖更有利于抗菌肽的合成，上清液效價達到了1 185.72 AU/mL，與NB培養基(空白CK組)相比，效價提高了近2倍。可見，以麥芽糖為碳源不僅能明顯促進抗菌肽合成，而且成本較低，可以作為工業化生產的碳源參考。

進一步對麥芽糖的添加量進行優化(圖2)，當添加量為10.0 g/L時，最利于抗菌肽的合成。麥芽糖具有一定黏度，添加量過高可能會導致溶氧量降低從而影響菌體生長。

2.3 培養基氮源優化

對于L.enzymogenesL-43來說，氮源不僅是支持菌體生長繁殖的必需營養物質，更是支持合成代謝物抗菌肽的原料。本研究對9種有機氮源與3種無機氮源進行了篩選，結果如圖3所示。當培養基中不添加氮源時，發酵效價僅為44.31 AU/mL，說明氮源是影響抗菌肽合成的重要因素。此外，氮源的種類也影響了抗菌肽的合成。與常見的牛肉膏、蛋白胨相比，胰蛋白胨作為氮源更能促進L.enzymogenesL-43抗菌肽的合成，其發酵液效價達到了2 281.30 AU/mL。

1-空白組；2-胰蛋白胨；3-牛肉膏；4-蛋白胨；5-酪蛋白胨； 6-魚蛋白胨；7-玉米浸粉；8-酵母膏；9-酵母浸粉；10-NH4Cl； 11-NH4NO3；12-(NH4)2SO4；13-尿素圖3 氮源對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.3 Effect of different nitrogen on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

進一步優化胰蛋白胨的添加量(圖3)。當添加量為10.0 g/L時，抗菌肽合成量最高，效價達到了2 390.02 AU/mL，而當添加量低于10.0 g/L或高于10.0 g/L時其合成量均呈現降低趨勢，這可能與培養基中的碳氮比有關。氮源能夠促進菌體的生長繁殖與代謝物的合成，但當氮源比例過高時，菌體生長旺盛，pH也隨之升高，并不利于代謝物的積累。

2.4 培養基無機鹽優化

L.enzymogenesL-43抗菌肽的合成需要多種酶作用，無機鹽與酶的激活等作用息息相關。本研究對9種無機鹽進行了篩選，其中包括對酶有激活作用的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+以及調節滲透壓的Na+等，結果如圖4所示。CaCl2、FeCl3、Fe2(SO4)3對抗菌肽的合成沒有明顯影響，ZnSO4、MnSO4、CuSO4、K2HPO4抑制抗菌肽的合成，NaCl與MgSO4會促進抗菌肽合成，其中MgSO4對L.enzymogenesL-43合成抗菌肽的促進作用最強，發酵效價達到了3 483.74 AU/mL，與其他無機鹽相比，較為突出。

1-空白組；2-MgSO4；3-NaCl；4-CaCl2；5-FeCl3；6-Fe2(SO4)3； 7-ZnSO4；8-K2HPO4；9-MnSO4；10-CuSO4圖4 無機鹽對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.4 Effect of different inorganic salt on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

進一步對MgSO4添加量進行優化(圖4)，當添加量為1.0 g/L時能夠顯著促進抗菌肽的合成。對于菌體來說，MgSO4作為無機鹽可以提供與酶活力息息相關的Mg2+，從而促進菌體的代謝。

2.5 培養基表面活性劑優化

表面活性劑對L.enzymogenesL-43抗菌肽合成量的影響結果如圖5所示。

1-空白組；2-吐溫-20；3-吐溫-80圖5 表面活性劑對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.5 Effect of different surface actie agents on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

培養基中加入2種表面活性劑對抗菌肽的合成均無促進作用，吐溫-20甚至會抑制L.enzymogenesL-43抗菌肽的合成。對吐溫-80的添加量進行優化，結果顯示，隨著添加量的增加，L.enzymogenesL-43抗菌肽合成量逐漸降低，可見加入吐溫-80并不利于抗菌肽的合成。

2.6 發酵培養基優化正交試驗

將碳源、氮源、無機鹽3個因素進行正交試驗，結果如表3所示，與其他組合相比，組合5的抗菌肽合成量最高，效價達到了3 770.52 AU/mL，與NB培養基中發酵效價(602.32 AU/mL)相比，提高了6.26倍。最終確定優化的培養基組合為A2B2C3，即麥芽糖10.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，MgSO41.5 g/L。

表3 發酵培養基成分正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of fermentation culture

2.7 發酵初始pH優化

同一種微生物在不同生長階段或生理生化過程中對pH值有不同的要求。對L.enzymogenesL-43合成抗菌肽的初始pH進行優化，結果如圖6-a所示。圖6-a顯示，隨著初始pH的逐漸升高，抗菌肽合成量先增高后降低。當初始pH為6.5時，合成量最高，效價達到了4 335.34 AU/mL；pH高于6.5后，隨著pH的升高，效價逐漸降低；pH為10時，效價最低，這可能是由于pH太高，導致菌體死亡或不能生長，從而抑制抗菌肽合成。

2.8 發酵溫度優化

對L.enzymogenesL-43的發酵溫度進行優化。根據菌體生長的溫度規律，分別設置了5個溫度進行發酵，結果如圖6-b所示。L.enzymogenesL-43在28 ℃不能高效地合成抗菌肽，隨著溫度升高，抗菌肽合成量逐漸提高，至32 ℃時，抗菌肽合成量最高，效價達到了5 186.32 AU/mL；發酵溫度高于32 ℃后，抗菌肽合成量又逐漸降低，這可能與抗菌肽合成酶的催化溫度有關。

2.9 發酵時間優化

抗菌肽作為L.enzymogenesL-43合成分泌的一種代謝物，會隨著培養時間的延長而積累。本研究分別設置了9個時間點，探究L.enzymogenesL-43抗菌肽在發酵培養基中的合成情況。結果如圖6-c所示，當菌體發酵至16 h時，抗菌肽合成量仍處于持續上升的趨勢，直至22 h效價最高，達到5 664.47 AU/mL；隨著時間的延長，效價又逐漸下降，至24 h后，效價幾乎穩定不變。隨著發酵時間的延長，菌體量增多，導致培養基內營養成分減少，從而不利于抗菌肽的合成，綜合考慮發酵時間確定為22 h。目前，產酶溶桿菌抑菌物質的發酵周期較長，幾乎均在24 h以上[23,25-27]。本研究將L.enzymogenesL-43抗菌肽的發酵時間縮短至22 h，有效縮短了發酵周期，降低了發酵成本。

a-初始pH；b-發酵溫度；c-發酵時間圖6 發酵初始pH、發酵溫度與發酵時間對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.6 Effect of different fermentation initial pH, temperature and time on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

2.10 接種量優化

對菌體接種量進行優化，結果如圖7-a所示。隨著接種量的增加，抗菌肽合成量也逐漸提高。當接種量為3.0%(體積分數，下同)時抗菌肽合成量最高，效價達到了5 961.75 AU/mL；當接種量超過3.0%時，抗菌肽合成量開始逐步降低，至接種量4.0%時其合成量趨于穩定。

2.11 發酵溶氧量優化

適宜的溶氧水平有助于菌體的生長與代謝。本研究從轉速與裝液量的角度對發酵溶氧水平進行調整。觀察轉速對抗菌肽合成的影響，結果如圖7-b所示，當搖床轉速在180～220 r/min時，抗菌肽合成量隨著轉速的升高而降低；當轉速上升至220～240 r/min時，抗菌肽合成量又逐漸升高；當轉速上升至240～260 r/min時，抗菌肽合成量呈現降低的趨勢。綜合比較，確定發酵的轉速為180 r/min，此時抗菌肽發酵效價最高，達到了6 876.55 AU/mL。

對發酵裝液量進行優化，結果如圖7-c所示，當裝液量為30 mL/250 mL時，抗菌肽的發酵效價達到了最高(8 421.02 AU/mL)；隨著裝液量的增加，發酵效價逐漸降低，裝液量超過60 mL/250 mL，發酵效價顯著下降。裝液量的增加導致溶解氧降低，從而影響菌體的生長與代謝。

a-接種量；b-搖床轉速；c-裝液量圖7 接種量、搖床轉速與裝液量對L.enzymogenes L-43合成抗菌肽的影響Fig.7 Effect of different inoculum amount, shaking speed and liquid loading on the antimicrobial peptides production by L.enzymogenes L-43

2.12 發酵條件優化正交試驗

對發酵條件的4個因素分別設置4個水平進行正交試驗。結果如表4所示，對抗菌肽效價影響的顯著程度依次是pH>裝液量>發酵時間>接種量；與其他組合相比，第11組試驗E3F3G1H2的抗菌肽合成量尤為突出，效價達到了9 422.33 AU/mL，與NB培養基中發酵效價(602.32 AU/mL)相比提高了15.6倍。通過正交試驗確定發酵條件為裝液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接種量2.0%，發酵時間22 h。

表4 發酵條件正交試驗結果Table 4 Orthogonal test results of fermentation conditions

3 結論與討論

產酶溶桿菌具有廣譜的抑菌能力與多種生防機制[28-30]，在食品、農業與醫學等方面均具有廣闊的應用前景。目前，產酶溶桿菌的生防能力以及對作物病害的防治研究已經有了較大進展，但與其他類生防菌相比，開發利用的產酶溶桿菌仍較少[30-31]。因此，開發新型、優良的產酶溶桿菌仍是研究的重點。利用廉價易得的原料對菌株進行發酵，優化其培養環境，降低發酵成本，獲得較高的產物濃度、較高的底物轉化率和較高的生產強度，是菌株開發的重要環節。

本研究從發酵培養基與發酵條件的角度對產酶溶桿菌L-43合成抗菌肽進行優化，分別對10種碳源、12種氮源、9種無機鹽以及2種表面活性劑進行篩選，得到了以麥芽糖為碳源、胰蛋白胨為氮源、MgSO4為無機鹽的發酵培養基，優化后抗菌肽效價達到了3 770.52 AU/mL，與最初發酵效價相比(602.32 AU/mL)提高了6.26倍，且有效降低了發酵培養基成本。在優化發酵培養基的基礎上對培養基初始pH、裝液量、接種量、搖床轉速、發酵溫度以及發酵時間6個發酵條件進行優化，獲得了初始pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL、接種量2.0%(體積分數)、發酵溫度32 ℃、搖床轉速180 r/min和發酵時間22 h的組合，優化后抗菌肽的效價達到了9 422.33 AU/mL，與最初發酵效價相比(602.32 AU/mL)提高了15.6倍。

2019年，CHEN等[26]從碳源、氮源、無機鹽以及初始pH角度對產酶溶桿菌在搖瓶中合成抗菌肽WAP-8294A的產量進行了優化，得到了以葡萄糖、牛肉膏、大豆油、CaCO3、NaCl作為成分的發酵培養基與初始pH為8.5的發酵條件，發酵48 h，抗菌肽WAP-8294A的產量提高了近10倍，經過探究發現以雙糖作為碳源更能促進抗菌肽WAP-8294A的合成與菌體的生長，與本研究篩選出的麥芽糖結果相吻合。但不同的是，與CHEN等篩選出的CaCO3作為無機鹽相比，MgSO4作為無機鹽更能促進產酶溶桿菌L-43合成抗菌肽，且初始pH為7.0時更適宜菌體合成抗菌肽，這可能與菌體之間的代謝差異相關，需要后續進一步研究。與CHEN等優化的培養基相比，本研究獲得的培養基成分較為簡單，仍有效提高了抗菌肽效價。除此之外，本研究亦對菌體的發酵時間進行了優化，將發酵時間縮短至22 h，在保證產量的情況下節約了時間與成本；同時對初始pH、裝液量、接種量、發酵溫度以及搖床轉速進行了優化，使產量進一步得到了提高，這也為后期產酶溶桿菌的放大生產以及抗菌肽的應用等研究提供了參考。