氨肽酶產生菌篩選及其對乳肽發酵脫苦的研究

陳國恒，李靜，鄧毛程，譚才鄧，葉茂，吳林杰，李美玲，謝擁葵

1(新疆天牛乳業有限公司，新疆 伊犁，835700)2(廣東輕工職業技術學院 食品與生物技術學院，廣東 廣州，510300)

肽是含有2個至幾十個氨基酸殘基的特定蛋白質片段，其中，肽鏈上含有10個及以上氨基酸的肽稱為多肽，含有2～9個氨基酸的肽稱為寡肽，含有2～4個氨基酸的肽又稱為小分子肽[1]。20世紀80年代初，GARDNER等研究人員證明了寡肽不需被分解為游離氨基酸，而可以直接被機體吸收，在被消化吸收方面具有蛋白質無法比擬的優點[2-3]。肽鏈通常因氨基酸組成及排列方式不同，會表現出不同的生理調節功能[4]。乳蛋白重要功能是提供氨基酸和氮，是膳食蛋白質的重要組成部分，促進多種重要營養物質的吸收，如微量元素和維生素。此外研究表明，乳源蛋白質經降解，可釋放出具有血管緊張素轉換酶抑制活性、抗氧化活性、抗菌活性、免疫調節活性和阿片樣活性的肽類物質，例如，由牛乳αs1酪蛋白中的23～34、23～27、194～199氨基酸殘基和β酪蛋白的177～183氨基酸殘基組成的4個寡肽具有抗高血壓活性，由牛乳β酪蛋白的60～64氨基酸殘基組成的β-酪啡肽5具有很強的阿片樣活性，可發揮鎮靜、鎮痛、刺激胰島素和生長激素釋放、免疫調節等功能[5-9]。近年來，乳源蛋白肽的研究及應用是食品領域的熱點。但是，乳源蛋白質經水解，一些水解產物末端暴露了疏水性氨基酸殘基，與味蕾上的受體蛋白接觸會產生苦味[10]，從而限制乳源蛋白肽在食品領域的應用。

酸奶可以滿足乳糖不耐癥人群對乳制品的需求，提供豐富的蛋白質和鈣，在發酵過程中產生的一些生理活性物質可以抑制有害微生物的增殖，維持腸道菌群平衡，對慢性疾病有一定功效，但不易于保藏，酸奶粉具有保質期長、便于儲存等優點，已形成了商品化生產[11-12]。但是，由于寡肽苦味困擾，市場上尚未有富含寡肽的酸奶粉。本文篩選高產氨肽酶的乳酸菌，并利用該菌種對乳源蛋白肽進行脫苦研究，以期為解決富含寡肽酸奶粉的苦味問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

自然發酵馬奶、脫脂牛乳，新疆天牛乳業有限公司提供。DNA提取試劑盒、16S rDNA的擴增引物以及PCR擴增試劑，其中細菌通用引物27F/1492R，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，購于深圳華大基因科技服務公司。葡萄糖、酪蛋白胨、酵母粉、脫脂奶粉、NaCl、瓊脂、HCl、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、L-亮氨酸對硝基苯胺，市售。

1.2 主要儀器

SW-11厭氧培養箱，上海勝衛電子科技有限公司；S-300掃描電鏡，日本日立公司；A200型PCR儀，杭州朗基科學儀器有限公司；酶解罐、種子罐、發酵罐，新疆天牛乳業有限公司；H1850R高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；752 N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；LNG-UF-101超濾膜分離裝置，上海朗極膜分離設備工程有限公司。

1.3 平板分離

平板分離培養基(g/L)：乳糖10，酪蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，瓊脂18，調節pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。用無菌生理鹽水對自然發酵馬奶進行梯度稀釋，涂布于平板分離培養基上，37 ℃厭氧培養72 h，挑取周圍有透明圈的菌落。

1.4 氨肽酶產生菌篩選

種子培養基(g/L)：乳糖40，脫脂奶粉5，酪蛋白胨20，酵母粉5，調節pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。發酵培養基同種子培養基。將上述挑取菌落的斜面菌種分別接入10 mL種子培養基，于37 ℃厭氧培養8 h，再分別接入200 mL發酵培養基，于37 ℃厭氧培養16 h。然后，測定發酵液中氨肽酶活力，優選產酶能力最強的菌株。

1.5 氨肽酶產生菌鑒定

利用普通光學顯微鏡和掃描電鏡觀察菌體形態。按照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)的方法[13-14]，對菌種的生理生化特性進行分析。參照文獻[15]的分子生物學鑒定方法，對菌種進行16S rDNA測序。將序列在NCBI中進行同源性檢索，利用MEGA7.0軟件以Neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.6 發酵產酶條件的優化

用20 kDa超濾膜濃縮脫脂牛乳至一半體積，按蛋白質含量加入5 000 U/g風味蛋白酶，于55 ℃下進行酶解3 h，升溫至90 ℃滅酶。將5 L牛乳酶解液放入錐形瓶，于105 ℃滅菌10 min，冷卻后，接入氨肽酶產生菌的斜面菌種，于37 ℃下培養8 h，作為發酵種子液。將100 L牛乳酶解液放入發酵罐，于105 ℃滅菌10 min，冷卻后，接入上述種子液，分別在不同溫度下和不同初始pH的條件下進行氨肽酶發酵，優選最佳的發酵產酶條件。

1.7 發酵脫苦時間的優化

在最佳溫度和初始pH條件下進行發酵，從發酵9 h開始，每隔3 h取樣評價苦味強度，優選最佳的脫苦時間。

1.8 氨肽酶測定方法

采用LNA法測定粗酶液的酶活力[16]。測定前，配制一系列對硝基苯胺的標準溶液，在405 nm下測定吸光度，繪制標準曲線。將發酵液于8 000 r/min、4 ℃的條件下離心15 min，收集上清液，即為粗酶液。在具塞試管中，依次加入Tris-HC1緩沖溶液、L-亮氨酸對硝基苯胺和粗酶液，在40 ℃水浴反應10 min，用30%乙酸終止反應，在405 nm波長下測定吸光度，根據標準曲線的回歸方程計算酶活力。酶活力定義：在40 ℃的條件下，1 min分解L-亮氨酸對硝基苯胺產生1 nmol對硝基苯胺所需的酶量即為1個酶活力單位。

1.9 苦味強度評價方法

將不同發酵時間的發酵液與等體積純凈水混勻，用360 Da超濾膜進行濃縮至一半體積，收集濃縮液，用于苦味強度評價。參照文獻[17]的苦味評價方法，以0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4、0.5×10-5、0.5×10-6g/L的硫酸奎寧溶液為苦味強度參照物，分別對應5個苦味強度級別：強、較強、中、弱、無，由11名人員組成的小組進行感官評價。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

從分離平板上挑取126個周邊有透明圈的菌落，經過氨肽酶發酵篩選，發酵16 h的氨肽酶活力分布于302～1 962 U/mL。發酵液中氨肽酶活力最強的10個菌株產酶情況如圖1所示，其中，菌種KM-022發酵液的酶活力最高，與有關文獻報道的德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌等乳酸菌相比[18-19]，屬于產酶能力較強的氨肽酶產生菌，故優選為進一步實驗的研究菌種。

圖1 十株菌發酵液中的酶活力Fig.1 Enzyme actiity in fermentation broth of 10 strains

2.2 菌種鑒定

經革蘭氏染色與顯微鏡觀察，菌種KM-022的菌體形態呈球形，是革蘭氏陽性菌。在掃描電鏡下觀察，菌體的呈現形式主要是2個卵圓形菌體連成的長鏈，長度約為1.0～1.4 μm(圖2)。

圖2 菌種KM-022的電子顯微鏡掃描結果Fig.2 Scanning electron microscope result of strain KM-022

菌種KM-022的生理生化試驗結果如表1所示，該菌種具有耐熱性能，能夠在15～45 ℃生長，其明膠液化試驗為陽性，表明能夠產生蛋白酶。

表1 菌種KM-022生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain KM-022

經測序，16S rDNA序列為1 539 bp，在NCBI中Blast比較后，發現該菌種與嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的許多菌種序列同源性達到99%以上，采用MEGA10的Neighbor-joining法構建系統發育樹，如圖3所示。

圖3 菌種KM-022的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain KM-022

菌種KM-022與菌株StreptococcusthermophilusA7033(登錄號：MN447108.1)遺傳距離最近，結合形態觀察和生理生化試驗，菌種KM-022被鑒定為嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)。研究表明，嗜熱鏈球菌可產生包括氨肽酶T、氨肽酶N、氨肽酶C、Xaa-Pro氨肽酶、三肽氨肽酶、谷酰基氨肽酶、蛋氨酸氨肽酶等氨肽酶[20]，已有多個氨肽酶基因被克隆和研究，包括pepN、pepC、pepS等基因序列，通過轉錄組和蛋白質組學方法研究，表明嗜熱鏈球菌生長后期上調表達的蛋白質有肽類與氨基酸運載體及特定氨基酸合成[21-22]，這與菌種KM-022具有氨肽酶產生能力的性質是一致的。

2.3 溫度對產酶的影響

在初始pH 7.0和不同溫度下，嗜熱鏈球菌KM-022產氨肽酶的結果如圖4所示。分別在37、40、43 ℃的條件下進行發酵，發酵液中酶活力最大值均出現在18 h，分別為2 097、2 416、2 203 U/mL，隨后呈下降趨勢。在40 ℃下發酵的酶活力最高，故嗜熱鏈球菌KM-022氨肽酶發酵最適溫度優選為40 ℃。其最適產酶溫度與該菌種以及文獻報道的其他菌株的最適生長溫度是一致的[23-24]，表明該菌種在生長和發酵過程中均有較好的耐熱性能。

圖4 溫度對產酶的影響Fig.4 Influence of temperature on enzyme production

2.4 初始pH對產酶的影響

在不同初始pH和40 ℃下，嗜熱鏈球菌KM-022產氨肽酶的結果如圖5所示。分別在初始pH 6.5、7.0、7.5下進行發酵，發酵液中酶活力最大值分別出現在18、18、21 h，分別為2 135、2 416、2 197 U/mL，隨后呈下降趨勢。在初始pH 7.0下發酵的酶活力最高，故嗜熱鏈球菌KM-022氨肽酶發酵最適初始pH優選為7.0。

圖5 初始pH對產酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on enzyme production

2.5 時間對短肽脫苦的影響

在初始pH 7.0和40 ℃下，嗜熱鏈球菌KM-022發酵脫苦的結果如表2所示。在產酶以后，產酶和酶解作用是同步的，隨著發酵產酶和氨肽酶酶解作用的進行，發酵液的苦味強度逐漸減弱，發酵21 h的苦味基本消失。該條件下發酵液最高酶活力出現在18 h，脫苦效果僅延遲3 h，表明該菌種對牛乳酶解液的發酵脫苦效果良好。

表2 發酵濃縮液的苦味強度變化Table 2 Bitterness intensity of concentrated fermented liquid

3 結論

從自然發酵馬奶中分離得到126株氨肽酶產生菌株，經產酶發酵篩選，確定菌種KM-022產酶能力最強。經菌體形態觀察、生理生化試驗和16S rDNA分子鑒定，菌種KM-022被鑒定為嗜熱鏈球菌，屬于我國可用于食品的微生物菌種。利用脫脂牛乳的酶解液為基質進行氨肽酶發酵，產酶的最佳溫度和初始pH分別為40 ℃和7.0。在最佳溫度和初始pH的條件下，嗜熱鏈球菌KM-022發酵18 h的氨肽酶酶活力達到最大值2 416 U/mL，發酵21 h苦味基本消失。該菌種對乳肽的發酵脫苦效果明顯，具有生產應用潛力。