低亞硝酸鹽柳州酸筍的研制及品質分析

劉永逸，林華，楊超，楊宛螢，彭幫柱*

1(柳州市質量檢驗檢測研究中心，廣西 柳州，545001)2(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070) 3(果蔬加工與品質調控湖北省重點實驗室(華中農業大學)，湖北 武漢，430070)

酸筍主要以新鮮竹筍為原料，在低鹽條件下密封發酵而成，發酵后的酸筍富含人體必需氨基酸和膳食纖維，具有降血脂、增強免疫力等保健功能[1]。在酸筍發酵過程中，硝酸鹽在微生物所產生的硝酸還原酶的作用下生成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽含量超標會影響酸筍品質[2]。過量攝入亞硝酸鹽會引起人體中毒，導致高鐵血紅蛋白癥，世界衛生組織規定亞硝酸鹽每日攝入量限量為0.06 mg/kg[3-4]。

目前，對酸筍的研究主要集中在乳酸菌的篩選、營養物質和風味成分的解析。孫寧等[1]對自然發酵酸筍中的乳酸菌進行了篩選和鑒定，發現6株具有良好的益生性能和體外抗氧化活性的乳酸菌；郭榮燦等[5]對發酵酸筍氣味物質的提取方法進行了優化，發現頂空固相萃取法為最佳萃取方法；朱照華[6]發現酚類、醇類、酸類和醛類物質為自然發酵酸筍的主要揮發性風味物質。然而現階段對于研制低亞硝酸鹽酸筍及其品質分析的報道較少，傳統發酵酸筍存在發酵周期長、亞硝酸鹽含量高等問題[7]，有研究表明乳酸菌在發酵過程中能夠有效減少亞硝酸鹽含量，其產生大量的乳酸有抑菌作用，能有效防止酸筍的腐敗變質[8]。

本研究選用實驗室保存的乳酸菌接種于酸筍發酵中，并與自然發酵酸筍對比分析。通過對酸筍發酵過程中各項理化指標及亞硝酸鹽含量的檢測和發酵后酸筍的質構分析，結合GC-MS解析發酵后酸筍的風味成分，研制低亞硝酸鹽的發酵酸筍，以期為規模化生產安全性高和風味獨特的柳州酸筍提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮采摘竹筍，購于廣西柳州；乳酸菌菌株，分離自廣西柳州酸筍發酵液中，保存于柳州市質量檢驗檢測研究中心。

MRS肉湯培養基、MRS固體培養基,青島海博生物技術有限公司；食鹽，市售；NaNO2、NaOH、硼砂、乙酸鋅、K4Fe(CN)6、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

YX-280高壓蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫療設備有限公司；U-1750紫外可見分光光度計，日本島津公司；ZXDP-B1160生化培養箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；PHS-3C pH計，上海精科儀器有限公司；TA.XT.Plus質構儀，英國Stable Micro System公司；Agilent 7000D/8890氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫儀器有限公司；50/30 μm DB/CAR/PDMS纖維萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將保存于-80 ℃的3株取自柳州酸筍發酵液中的乳酸菌(P51、P52、P53)解凍后，取1環接種于50 mL MRS液體培養基中(121 ℃滅菌20 min)，37 ℃恒溫靜置培養24 h。按接種量2%(體積分數，下同)接種至50 mL MRS液體培養基中并擴大培養22 h。

1.3.2 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力測定

以2%的接種量將活化后的乳酸菌P51、P52、P53分別接種于含有150 mg/L NaNO2的MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養48 h，取樣并測定亞硝酸鹽含量[9-10]。亞硝酸鹽含量的測定參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，標準曲線為y=0.600 1x+0.007 6，R2=0.999。

1.3.3 生長曲線的測定

取適量活化兩代的乳酸菌P51 8 000 r/min離心10 min后用無菌水洗滌2次，重懸乳酸菌細胞并以2%接種量接種于50 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養并測定乳酸菌在600 nm處的吸光值以確定其生長情況[11]。

1.3.4 酸筍的發酵工藝

本實驗選用產自廣西柳州的新鮮無蟲害竹筍，采取自然發酵和純種乳酸菌發酵酸筍，發酵工藝如下：

自然發酵：新鮮竹筍→去根、去殼→清洗、切塊→鹽漬(6%食鹽水)→密封發酵

純種乳酸菌發酵：新鮮竹筍→去根、去殼→清洗、切塊→熱水燙煮2 min→鹽漬(6%食鹽水)→接種乳酸菌(接種量為0.04 g/kg)→密封發酵

1.3.5 酸筍發酵過程中各項理化指標的檢測

酸筍發酵周期為14 d,每隔2 d取樣。參照GB 12456—2008《食品中總酸的測定》測定pH值和總酸含量；參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》中直接滴定法測定還原糖含量；參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸奈乙二胺比色法測定亞硝酸鹽含量。每個實驗組設置3個平行。

1.3.6 酸筍的品質分析

對發酵后的酸筍進行品質分析，選取形狀、大小盡量一致的酸筍，將其切成4 cm長。使用質構儀檢測發酵后酸筍的硬度和脆度，檢測模式為穿刺模式，實驗參數參考劉洪等[12]的研究并略作修改。選用P/2 N-2 mm不銹鋼針形探頭，測前速度1.0 mm/s、測試速度3.0 mm/s、測后速度10.0 mm/s、穿刺距離5 mm、觸發力3.0 g。樣品測試5次取平均值。

1.3.7 酸筍的感官評價

對發酵后酸筍進行感官評價，由8人組成感官評價小組(4男4女，包括2名感官評價專家)，分別從酸筍的色澤、口感、滋味和風味3方面進行評分，評分標準如表1所示。

表1 不同發酵方式的酸筍感官評價標準Table 1 Sensory ealuation standard of sour bamboo shoots with different fermentation methods

1.3.8 酸筍風味成分分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀分析發酵后酸筍的風味成分。將發酵14 d的自然發酵酸筍和純種乳酸菌發酵酸筍剁碎后取8 g分裝至20 mL頂空瓶中，于80 ℃平衡10 min后，插入經老化處理后的萃取頭，頂空吸附30 min后將萃取頭插入進樣品口解析5 min。氣相色譜條件：毛細管柱為HP-5 (30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至250 ℃，保持3 min；載氣He，流速1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量1.0 μL。質譜條件：電子電離源EI，電子能量70 e，四級桿溫度和離子源溫度分別為150 ℃和200 ℃，數據采集為全掃描[13]。在NIST 05質譜庫中分析檢測到的揮發性風味物質質譜數據。

1.4 數據處理與分析

實驗重復2次，采用Excel處理實驗數據，SPSS 22.0對數據進行分析并用Origin 2018繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力及生長曲線測定

將活化兩代的乳酸菌(P51、P52、P53)分別加入到含有150 mg/L NaNO2的MRS液體培養基培養48 h后，NaNO2含量分別為0.069、10.071、16.545 mg/L，其降解率分別為99.95%、93.29%和88.97%。3株乳酸菌均具有較高的亞硝酸鹽降解能力，其中菌株P51降解能力最強，故選擇該菌株接種于后續酸筍發酵過程中。

如圖1所示，乳酸菌P51在營養物質充足條件下，培養6 h后呈對數生長，在培養20 h后進入穩定期，因此將活化20 h的乳酸菌用于酸筍發酵。

圖1 乳酸菌生長曲線Fig.1 The growth cure of lactic acid bacteria

2.2 酸筍發酵過程中pH值和總酸含量的變化

如圖2所示，酸筍初始pH為6.96，發酵過程中，發酵液pH值隨時間的變化逐漸降低，且純種發酵酸筍的pH值均低于自然發酵；總酸含量逐漸增多且純種發酵中總酸含量高于自然發酵。

a-pH值；b-總酸含量圖2 酸筍發酵過程中pH值和總酸含量的變化Fig.2 Changes of the pH, total acid content of sour bamboo shoots during fermentation

在發酵前期，乳酸菌生長代謝迅速，發酵液的總酸含量不斷增加且pH值顯著下降；在發酵后期，pH值逐漸降低且變化速率趨于平緩，總酸含量在發酵第12天達到最大值后略有降低，這是由于大量乳酸的積累抑制了乳酸菌的生長，降低了其產酸能力[14]。

研究表明，當泡菜液的pH值為3.5～3.8時，發酵結束[15]。在發酵第6天時，純種發酵酸筍發酵液pH值為3.73，總酸含量為0.39%；而自然發酵酸筍在第12天時，pH值為3.69，總酸含量為0.48%。乳酸菌在生長代謝過程中，能產生大量乳酸和乙酸等物質[16]，在純種發酵酸筍中，乳酸菌作為優勢菌群其繁殖速度更快，產酸更多，因此純種乳酸菌發酵酸筍能顯著縮短酸筍的發酵周期。

2.3 酸筍發酵過程中還原糖含量的變化

由圖3可知，2種不同發酵方式的發酵液中還原糖含量均呈下降趨勢。在第2～6天時，乳酸菌的生長代謝需消耗碳源，因此還原糖消耗速率較快；發酵第8～14天時，還原糖含量逐漸減少。在自然發酵酸筍中存在大量微生物，乳酸菌含量較少，因此在發酵過程中其還原糖消耗速率均低于純種乳酸菌發酵酸筍。

圖3 酸筍發酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content of sour bamboo shoots during fermentation

2.4 酸筍發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

自然發酵和純種發酵酸筍在發酵過程中亞硝酸鹽含量均低于GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中的限量標準。如圖4所示，純種發酵和自然發酵酸筍分別在第6天和第10天時產生“亞硝峰”，亞硝酸鹽含量分別為1.815 mg/kg和2.157 mg/kg。

圖4 酸筍發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes of nitrite content of sour bamboo shoots during the fermentation

在第14天時，純種發酵和自然發酵酸筍中亞硝酸鹽含量最低，分別為0.431 mg/kg和0.716 mg/kg。說明純種發酵所接種的乳酸菌P51具有高效降解亞硝酸鹽的能力，有效減少了酸筍發酵過程中亞硝酸鹽的產生，因此純種乳酸菌發酵酸筍具有更高的食用安全性。

2.5 發酵酸筍的質構分析

發酵后酸筍口感清脆，風味獨特，酸筍的硬度和脆度與發酵過程中微生物、酶及原果膠含量有關[15,17]。用質構儀檢測2種不同發酵方式酸筍的硬度和脆度，如表2所示，純種乳酸菌發酵酸筍的硬度和脆度均優于自然發酵，這可能是由于發酵后期，純種發酵酸筍的pH值較低，抑制了乳酸菌P51的生長，減少了酶類的產生，降低了酸筍中原果膠的水解作用。

表2 不同發酵方式酸筍的質構分析Table 2 Texture analysis of sour bamboo shoots with different fermentation methods

2.6 發酵酸筍的感官評價分析

在發酵第14天，自然發酵和純種發酵酸筍中亞硝酸鹽含量均低于國家衛生標準，可用于感官評價。如表3所示，純種發酵酸筍在色澤和口感上均優于自然發酵，其色澤均勻，呈乳白色，口感清脆，感官脆度與質構分析結果一致；在滋味和風味方面評分略低于自然發酵，自然發酵酸筍香味更濃郁，這可能與自然發酵過程中微生物種類較多有關。綜上，純種發酵酸筍感官評價優于自然發酵酸筍。

表3 不同發酵方式酸筍的感官評分比較Table 3 Comparison of sensory scores of sour bamboo shoots with different fermentation methods

2.7 發酵酸筍的風味成分分析

通過GC-MS對發酵后酸筍的風味成分進行分析，在自然發酵和純種發酵酸筍中，揮發性風味成分主要由酯類、醛類、酚類和醇類等物質組成。如圖5所示，純種乳酸菌發酵酸筍中酯類物質含量高于自然發酵，其中乙酸甲酯含量最高(17.56%)，賦予酸筍一定的清香香味，此外乙酸苯酯(5.77%)、庚酸乙酯(2.45%)、辛酸甲酯(2.13%)、亞油酸乙酯(1.97%)、水楊酸甲酯(1.48%)等酯類物質也影響酸筍的風味。純種發酵酸筍中醛類物質含量低于自然發酵，苯甲醛具有發霉的味道，其含量在2種酸筍的醛類物質中最高，分別為8.71%和16.37%。酚類物質具有一定的刺激性氣味，有研究表明對甲苯酚是賦予發酵酸筍酸臭味的最主要成分[7,18]，2種方式發酵的酸筍中對甲苯酚含量分別為11.23%和10.63%。醇類物質具有花果香味[19]，2種方式發酵酸筍的醇類物質含量相近，主要為乙醇、苯乙醇、環乙醇、2-壬醇等物質。此外，醚類、酮類、酸類、烷類和烯類物質在酸筍中也有檢出，但其種類和含量較少。

由圖5可知，自然發酵和純種發酵酸筍中風味成分的含量略有不同，但風味物質的種類較為接近，說明純種乳酸菌發酵酸筍具有和自然發酵酸筍相近的風味。

圖5 不同發酵方式酸筍中揮發性風味成分含量Fig.5 Analysis of olatile flaor components of sour bamboo shoots with different fermentation methods

3 結論與討論

本研究利用實驗室保存的乳酸菌P51接種于發酵酸筍中，分別從食用安全性、品質和風味等方面與自然發酵酸筍進行對比分析。結果表明純種乳酸菌發酵酸筍顯著降低了亞硝酸鹽的產生，在發酵第14天時亞硝酸鹽含量最低為0.431 mg/kg；pH值、總酸和還原糖含量變化速率較快，縮短了發酵周期；其硬度和脆度均優于自然發酵，且保留了與自然發酵酸筍相近的風味成分。綜上，純種乳酸菌發酵酸筍中亞硝酸鹽含量較低，具有更高的食用安全性，且在品質和風味上優于自然發酵酸筍，該研究為低亞硝酸鹽酸筍的工業化生產提供了一定的理論依據。