氮添加對竹屑堆肥及其栽培大球蓋菇的影響

吳一凡，張瑋，劉昊林，謝錦忠，陳勝

(中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江 杭州，311400)

大球蓋菇(Strophariarugoso-annulata)又名赤松茸、皺環球蓋菇，是國際菇類交易市場十大菇種之一，同時也是聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization,FAO)和世界衛生組織(World Health Organization,WHO)向發展中國家推薦栽培的食用菌之一[1-2]。大球蓋菇含有豐富的多糖、蛋白質、氨基酸和礦質元素，且抗逆性強，生物學轉換效率高，是較適宜竹林下套種的品種[3]。我國竹資源豐富，竹林生境良好，是套種大球蓋菇的優良場所。利用竹林砍伐廢棄物粉碎的竹屑或者竹材初加工廢棄物能夠栽培大球蓋菇等食用菌，是解決近年來純竹林經營效益下滑，竹林棄管問題的有效途徑[4]。

目前大球蓋菇的栽培方式主要以發酵料栽培為主[5]，將適宜食用菌栽培的碳源和氮源按合理的配比堆制發酵栽培食用菌，具有污染小、成本低、工藝簡單和經濟效益高的優點[6]。已有研究表明，氮添加是影響培養料發酵和食用菌生長發育的關鍵，培養料的含氮量直接影響了食用菌的產量與品質[7]。竹屑富含纖維素和木質素，是栽培食用菌的優良碳源，麥麩富含蛋白質，是優良的有機氮源，培養料添加麥麩能提高大球蓋菇菌絲的長勢與生長速度[8]。目前針對氮添加對木屑發酵栽培金針菇、雞腿菇、豬肚菇等食用菌產量與營養品質的影響已有充分報道[9-10]，但氮添加對竹屑發酵及其栽培食用菌的品質影響的研究還十分缺乏。為此，本研究以竹屑作為主要栽培基質，以麥麩作為氮素補充，測定不同氮添加量下竹屑發酵前后的理化性質，及其栽培大球蓋菇的菌絲生長、生物學效率、營養品質和重金屬殘留情況，探究氮添加對竹屑發酵及其栽培大球蓋菇的影響，確定竹屑發酵及其栽培大球蓋菇適宜的氮添加量。為大球蓋菇的栽培推廣提供理論依據，也為竹林經營與竹材廢棄物的資源化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗樣地

供試大球蓋菇母種購于福建省永安市西南真菌研究所，栽培種由中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所自主擴繁。竹屑購自杭州市富陽區，為毛竹(Phyllostachysheterocycla)粗加工下腳料，含氮量為2.6 g/kg，麥麩購于河南省永城市，含氮量為25.3 g/kg。

試驗樣地位于浙江省杭州市富陽區中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所(30°06′N，119°96′E)，屬亞熱帶季風性氣候，極端低溫-9 ℃，試驗地海拔120 m，坡向朝西，坡度約15°，郁閉度0.7，土壤為黃壤。

1.2 試驗設計

試驗設計4種氮量添加竹屑栽培基料，按質量配比分別為：100%純竹屑，96%竹屑+4%麥麩(T1)，92%竹屑+8%麥麩(T2)，84%竹屑+16%麥麩(T3)。各栽培料添加0.5%石灰后拌勻補水至含水量70%，置于內徑67.5 cm×48 cm×41 cm的泡沫箱內進行高溫發酵40 d，每10 d進行1次翻堆。基質發酵結束后，打開泡沫箱蓋透氣3 d。發酵前后取堆體中間層鮮樣，測定容重和孔隙度，并在26 ℃恒溫組培室內測定不同基質栽培大球蓋菇的菌絲生長速度和菌絲長勢。部分樣品風干、磨細、過40目篩后用于pH、電導率(electrical conductiity,EC)、全氮和有機碳的測定。

2020年8月25日，選取立地條件和經營水平基本一致的試驗樣地進行林下種植穴套種，每個種植穴直徑30 cm，穴間距20 cm，每個種植穴內播4 kg發酵料和200 g大球蓋菇栽培種，每個處理5個重復。2020年11月～2021年3月以種植穴為單元進行采收，統計各單元的鮮菇產量與出菇時間。清理菇表面的泥土與雜物后將鮮菇的菇蓋與菇柄分開，分別粉碎、勻漿用于蛋白質、可溶性糖、多糖、總酚和金屬離子的測定，并取部分鮮樣對半切開于105 ℃的烘箱中烘至恒重測定其含水率。

1.3 測定方法

1.3.1 竹屑發酵后理化性質的測定

竹屑的容重、孔隙度采用環刀法測定。將(樣品)∶(蒸餾水)=1∶5混合，再經振蕩后用電導率儀測定EC值，測定pH值。全氮采用半微量凱氏法測定，有機碳采用重鉻酸鉀容量法測定。

1.3.2 菌絲生長速度與生物學效率的測定

取各處理的等量發酵竹屑分別置于內徑12 cm，高10 cm的培養瓶中，每瓶接種2 g大球蓋菇原種后置于26 ℃恒溫組培室培養。待菌絲萌動后，每天觀察記載菌絲生長速度及長勢，試驗設3次重復。

出菇期間，當菌蓋未展開呈鐘型時，對每個種植穴的大球蓋菇進行采收稱質量，生物學效率按公式(1)計算：

(1)

1.3.3 大球蓋菇營養品質的測定

大球蓋菇的粗蛋白測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》第一法；可溶性糖測定參照NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測定 銅還原碘量法》；多糖測定參照《中國藥典》；總酚測定參照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定 分光光度法》；硒、鎘、鉛、汞和砷測定參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》中的電感耦合等離子體質譜法；鋅和鈣測定參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》中的電感耦合等離子體發射光譜法。

1.4 數據處理

試驗數據在Excel 2020和Origin 2019中進行整理和圖表制作，在SPSS 21.0中對數據進行分析處理，主成分評價時將有害元素(汞、鎘、鉛、砷)指標取倒數進行正向化處理。試驗數據顯著性水平為P<0.05，不同小寫字母表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 氮添加對竹屑堆肥理化性質的影響

如表1所示，T1、T2、T3處理發酵后竹屑培養料的容重、EC值顯著增大，孔隙度、pH顯著減小，對照組在發酵前后無顯著差異。隨著氮添加量的增加，發酵后竹屑培養料的EC顯著增加。T1、T2和T3處理的容重顯著高于CK，它們之間無顯著差異。T1和T2處理的孔隙度顯著低于CK和T3處理。可見，適宜的氮添加會促進竹屑發酵腐熟，改善竹屑的理化性質，適宜大球蓋菇栽培。

表1 各處理基質發酵前后理化性質Table 1 Physicochemical properties of substrates before and after fermentation

2.2 氮添加對竹屑栽培大球蓋菇生長的影響

如表2所示，隨著氮添加的增加，竹屑栽培大球蓋菇的菌絲生長速度呈現降低的趨勢，生長速度最高的T1處理與對照組之間無顯著差異，均顯著高于其他處理。菌絲長勢以T2處理為最佳，菌絲潔白粗壯且濃密。T1和T2處理之間的生物學效率無顯著差異，但均顯著高于其他處理，達到了84.25%和86.66%。可見，純竹屑栽培大球蓋菇菌絲生長速度快，但菌絲纖細且生物學效率低，一定的氮添加可以提高竹屑栽培大球蓋菇的生長勢，但過多的氮添加也會產生抑制作用。

表2 氮添加對大球蓋菇的生長指標的影響Table 2 Growth indexes of S. rugoso-annulata cultiated with nitrogen additions

2.3 氮添加對竹屑栽培大球蓋菇營養品質的影響

如表3所示，各處理菇柄的含水率均顯著高于菇蓋，蛋白質、多糖、鋅、硒在菇蓋中含量顯著高于菇柄，總酚在菇蓋與菇柄之間無顯著差異。CK組菇蓋的可溶性糖顯著高于菇柄，T2處理菇蓋的鈣顯著高于菇柄，其他處理均呈現菇蓋高于菇柄的趨勢，但未達到顯著水平。隨著氮添加量的增加，大球蓋菇中蛋白質含量也隨之增加，T3處理菇柄和菇蓋的蛋白質含量最高，達到了1.89%和4.11%，顯著高于其他處理。含水率和總酚在各處理之間無顯著差異，可溶性糖和多糖隨著氮添加量的增加分別有減少和增加的趨勢，但均未達到顯著水平。含量硒隨著氮添加量的增加呈“”型趨勢。各處理中，T2處理菇蓋的鈣顯著高于其他處理，但菇柄的鈣在各處理間無顯著差異。可見，氮添加對竹屑栽培大球蓋菇的不同營養指標有不同的影響。

表3 氮添加對栽培大球蓋菇的營養品質的影響Table 3 Nutritional compositions of S. rugoso-annulata cultiated with nitrogen additions

2.4 氮添加對竹屑栽培大球蓋菇重金屬含量的影響

由圖1可知，大球蓋菇各處理菇蓋的鎘含量均顯著高于菇柄，CK和T3處理菇蓋的汞含量顯著高于菇柄，CK和T2處理菇蓋的鉛含量顯著高于菇柄，CK組菇蓋的砷含量顯著高于菇柄。隨著氮添加量的增加，各處理間汞和鎘的含量呈“”型趨勢，T1和T2處理顯著低于其他處理；各處理間鉛含量無顯著差異；砷含量呈現下降的趨勢，CK組菇蓋顯著高于其他處理，但T1、T2、T3處理間無顯著差異。

a-汞；b-鎘；c-鉛；d-砷圖1 大球蓋菇重金屬的含量特征Fig.1 Content characteristics of heay metals in S. rugoso-annulata 注：不同小寫字母代表差異顯著(下同)

食用菌鮮品中的汞、鎘、鉛和砷的含量上限分別為0.1、0.5、1.0、0.5 mg/kg，對照組和T3處理的汞含量分別為0.133和0.104 mg/kg，超出國家食品安全限量。T2處理菇蓋的鎘含量最低，為0.49 mg/kg，接近安全限量臨界值，其他各處理菇蓋的鎘含量均超出國家食品安全限量，說明樣地大球蓋菇存在汞和鎘超標的風險。鉛和砷的殘留均在國家食品安全標準范圍內。T2處理菌蓋和菌柄的各項重金屬殘留均為最低，食用菌的安全品質較好。

2.5 氮添加對竹屑栽培大球蓋菇的主成分評價

將4個處理菇柄和菇蓋的7個營養品質指標和4個重金屬殘留指標經過主成分分析(principal component analysis，PCA)提取，第1、2、3個主成分的累積方差貢獻率達到了88.45%，可基本反映4個處理菇柄和菇蓋成分指標的大部分信息。第一主成分與汞的倒數高度正相關，第二主成分與鈣和可溶性糖高度正相關，第三主成分與多糖和總酚高度正相關。可見，鈣、汞的倒數、多糖、可溶性糖和總酚是評價大球蓋菇綜合品質的重要指標。可得大球蓋菇綜合品質得分計算公式如下：

F1=-0.048×ω(蛋白質)+0.183×ω(鈣)+0.376×ω(硒)+0.035×ω(鋅)+0.07/ω(砷)+0.212/ω(鎘)+0.157/ω(鉛)+0.435/ω(汞)+0.069/ω(多糖)+0.118×ω(總酚)+0.153×ω(可溶性糖)

F2=0.036×ω(蛋白質)+0.527×ω(鈣)-0.148×ω(硒)+0.117×ω(鋅)-0.18/ω(砷)-0.053/ω(鎘)-0.131/ω(鉛)+0.243/ω(汞)-0.045×ω(多糖)-0.246×ω(總酚)+0.34×ω(可溶性糖)

F3=0.174×ω(蛋白質)-0.239×ω(鈣)-0.082×ω(硒)+0.163×ω(鋅)+0.055/ω(砷)+0.072/ω(鎘)+0.097/ω(鉛)+0.061/ω(汞)+0.385×ω(多糖)+0.623×ω(總酚)-0.014×ω(可溶性糖)

FZ=32.501%×F1+29.966%×F2+23.078%×F3

大球蓋菇綜合品質得分結果表明(表4)，各處理菇蓋與菇柄之間綜合品質無顯著差異。隨著氮添加量的增加，各處理的綜合品質呈現倒“”型趨勢，對照組的綜合品質評分最低，T2處理的大球蓋菇綜合品質表現最好。

表4 大球蓋菇綜合因子得分Table 4 S. rugoso-annulata comprehensie factor score

2.6 培養料理化性質與大球蓋菇品質的相關性分析

由圖2可知，氮添加與EC、多糖、鋅、蛋白質呈顯著正相關，與菌絲生長速度、可溶性糖呈顯著負相關。生物學效率與汞、鎘、硒、砷呈顯著負相關，與鈣呈顯著正相關。菌絲生長速度和EC、容重呈顯著負相關。鎘、汞、鉛、硒、砷5種礦質元素之間均呈顯著正相關。多糖和可溶性糖呈顯著負相關。

圖2 生物學效率與各營養成分的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between biological conersion rate and nutrients

3 結論與討論

對竹屑進行適量的氮添加可以改善竹屑的理化性質，提升大球蓋菇的生物學效率與營養品質。培養料發酵后的理化性質直接決定著食用菌的生長發育。本研究中，竹屑經堆制發酵后，培養料的EC和容重增加，孔隙度、pH和C/N減小,這是因為竹屑經堆制發酵，有機物礦化，形成了可溶性鹽和有機酸[11]。

氮添加與大球蓋菇的生長與品質密切相關，T1和T2處理的配方均優于前人的結果[12]。純竹屑缺少大球蓋菇生長所需的氮，導致其生物學效率較低，生物學效率與氮添加呈倒“”型趨勢。隨著氮添加量的增加，培養料的容重和EC增加，大球蓋菇的生長速度降低，菌絲生長速度和培養料的EC、容重顯著負相關，這說明培養料的容重和鹽分過高會抑制大球蓋菇生長。培養料的C/N是影響食用菌生長的關鍵因素，T2和T3處理的終止碳氮比相近，但最高氮添加量的T3處理的竹屑發酵前后C/N降低幅度小，菌絲生長速度、菌絲長勢和生物學效率低，可能是因為氮添加過多產生過量的氨氣，會對微生物活動不利，導致竹屑未完全腐熟[13]，從而影響大球蓋菇的生長。

大球蓋菇子實體營養豐富，各處理菇蓋的蛋白質、多糖和礦質元素均顯著高于菇柄，這可能是因為菇蓋負責食用菌孢子的生殖發育，其營養富集能力較菇柄更強。總酚在各處理之間，菇蓋和菇柄之間均無顯著差異，這可能是因為酚類物質不參與食用菌的生殖發育，且酚類物質主要由碳氫氧構成，氮添加并不影響其合成。氮素是蛋白質重要的組成部分，大球蓋菇的蛋白質隨著氮添加量的增加而顯著增加。但可溶性糖和多糖分別呈現下降和上升的趨勢，可溶性糖和多糖呈顯著負相關，這可能是因為食用菌細胞壁內廣泛存在的幾丁質屬于含氮多糖[14]，氮添加會促使大球蓋菇中可溶性的氨基葡萄糖向其轉化。

硒是人體必須的微量元素之一，有較強的抗氧化活性[15]，竹子相對于其他樹木具有更強的硒富集能力，食用菌對硒也具有較強的生物富集與轉化能力[16]，本研究大球蓋菇中的硒含量均在安全限值內達到了富硒食品(0.02 mg/kg)的標準，說明竹屑栽培大球蓋菇可以作為良好的富硒農產品生產途徑進行推廣。鈣是信號傳導的關鍵元素、酶的活化劑，在食用菌孢子的形成中起重要作用[17]。T2處理菇蓋的鈣含量顯著高于菇柄，菇蓋鈣含量在各處理中最高，菇柄鈣含量最低，富集系數達到了221%，生物學效率和鈣呈顯著正相關。這可能是因為培養料添加石灰后鈣元素較富足，菌絲生長勢最優、生物學效率最高的T2處理具有更強的富集能力。

大球蓋菇雖然營養成分豐富，但其含有的金屬硫蛋白對重金屬也有較強的富集特性[18]，其子實體中重金屬等危害物質超標風險也是食品質量安全的關鍵問題[19]。本研究中，樣地大球蓋菇存在汞和鎘超標的風險，而其生物學效率和重金屬殘留顯著負相關，說明竹屑栽培大球蓋菇的蛋白質和重金屬主要來自于竹屑培養料，這可能是因為食用菌的富集作用。應避免采用重金屬殘留較高的培養料，或采用蚯蚓堆肥和添加石膏等措施來防控食用菌重金屬污染[20-21]。T2處理的大球蓋菇各項重金屬殘留均未超標，符合國家食品安全限量標準。通過PCA對多個指標進行綜合性評價[22]，得出T2處理的綜合品質最佳。

綜上，竹屑栽培大球蓋菇時，進行一定的氮添加，采用T2處理配方(92%竹屑+8%麥麩)，調節培養料初始碳氮比為100，堆制發酵后進行栽培，雖然生長速度有所延緩，但可以顯著提高其生物學效率和綜合品質，避免重金屬殘留超標的風險。