食用菌呈味肽制備及其呈味機理研究進展

林桐，趙吉春，雷小娟，雷琳，明建,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

食用菌又被稱作蕈，屬于大型真菌，遍布于世界各地，目前全球總產量已超過700萬t[1]。食用菌深受廣大消費者青睞，其獨特風味主要由揮發性和非揮發性成分組成，揮發性成分主導嗅覺帶來香氣，非揮發性成分更偏向于味覺帶來的滋味和口感，而非揮發性的成分在食用菌本身的風味研究以及后續食品開發上受到更多關注[2]。呈味肽在非揮發性成分中占有一定比例，在食品風味中起著重要作用。

呈味肽是一種小分子肽，相對分子質量通常在500～1 500 Da。直接為食品提供滋味的特征滋味肽在食用菌中被廣泛研究，包括甜味肽、苦味肽、鮮味肽、濃厚感肽等。研究表明，特定的氨基酸表現出特定的風味趨勢，但呈味肽與其等比混合物的風味效果并不相同，這表明呈味肽的風味特征還取決于其一級結構和氨基酸序列[2-3]。呈味肽已經在多種食物中被發現，食用菌味道鮮美且肽含量豐富，但目前對于食用菌呈味肽的研究還沒有得到足夠的關注。因此，本文對呈味肽的分類以及食用菌呈味肽來源進行了綜述，并歸納了食用菌呈味肽的呈味機理，以及制備、分離純化、鑒定方法，以期為后期食用菌呈味肽的開發和利用提供參考。

1 呈味肽分類及食用菌呈味肽來源

1.1 呈味肽分類及結構特點

最常見的呈味肽包括甜味肽、苦味肽、鮮味肽、酸味肽和咸味肽。相比較下，前3種肽對于滋味的貢獻更為直接，所以相關研究更廣泛。而酸味肽和咸味肽的呈味原理有所爭議，其呈味效果不能確定來自于肽本身或其攜帶的離子[4]。帶給食用菌菌體鮮美滋味的鮮味肽是研究重點(表1)。近年來針對食用菌風味的研究出現一種叫做濃厚感肽的呈味肽，它所帶來的滋味區別于上述的5種口味，濃厚感肽本身沒有固有的味道，卻能使食用菌的口感更加豐富[5]。

表1 食用菌呈味肽Table 1 Flaour peptides of edible mushrooms

1.1.1 甜味肽

甜味肽的甜味與其氨基酸的組成和種類密切相關。目前已知的幾種甜味氨基酸分別是脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和谷氨酰胺(Gln)[11]。甜味肽的呈味效果還與其一級結構有關，尤其是氨基和羧基的定位對甜味肽的呈味效果有一定影響[12]。

1.1.2 苦味肽

影響苦味肽呈味效果最主要的原因是它的疏水性殘基[13]。一些特定氨基酸，如精氨酸(Arg)、組氨酸(His)和賴氨酸(Lys)等堿性氨基酸，以及肽的疏水性可以使肽苦味加強，尤其是針對一些小分子肽[14]。大多數食用菌中的苦味肽含量不高，并不具有味覺活性，但一些有滋補和藥用功能的食用菌，如靈芝等，口感略帶苦澀，而這些苦澀味的來源包含苦味肽，其被認定有免疫增強的作用[15]。

1.1.3 咸味肽

咸味肽的呈味效果與其所含氨基酸種類和排序的關系并不緊密，滋味與氨基的解離程度、是否有相關離子及離子濃度有關，陽離子被認為有呈味作用，而陰離子主要是輔助功能[16]。

1.1.4 酸味肽

關于酸味肽的研究報道并不多，但大多數酸味肽都含有酸性氨基酸谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)，這說明酸味的來源與肽電離后產生的陽離子H+有關。但是單獨具有酸味的肽并不多，因為酸味肽所含有的酸性氨基酸通常也具有鮮味，所以酸味肽有時被認為是鮮味肽的一部分[17]。

1.1.5 鮮味肽

鮮味肽的鏈長在一定程度上影響著其呈味效果，鮮味肽的氨基酸骨架的一般結構式為—O—(C)n—O—，n=3～9，當n為4～9時鮮味最強[18]。通過對肽結構和組成的分析發現，鮮味肽普遍為含有Asp和Glu的親水性寡肽，但這2種氨基酸殘基本身并不具有鮮味，而是它們的鈉鹽會產生鮮味，因此Asp和Glu也被歸為鮮味或谷氨酸鈉樣氨基酸[2,19]。

1.1.6 濃厚感肽

濃厚感區別于已知的5種基本味道，是一種復雜的感覺，基本特征包括有厚度、黏稠感和持續性[20]。濃厚感肽主要可以分為3類，分別是谷氨酰肽、亮氨酸肽和其他無特異性的肽[21]。一些氨基酸的存在也被認為對濃厚感有貢獻，如Asp和Gly[5]。

1.2 食用菌呈味肽來源

食用菌因其感官特性、營養價值和藥用價值被視為佳肴，其中消費最多的是雙孢蘑菇，其次是側耳屬菌。食用菌是新的蛋白質來源，其蛋白質含量達到19%～37%(干重)，同時也可制備各種肽，呈味肽便是其中之一[22]。不同的菌株、部位和生長階段都對食用菌子實體中呈味肽的種類和含量有影響[23]。

大多數食用菌表現出鮮甜的口感，這與其中的鮮味肽和甜味肽有一定關系。用酶解法提取香菇、平菇、金針菇和山毛菇4種食用菌中的呈味肽，蛋白質水解產物含量無顯著差異，但山毛菇能制備出更多的鮮味肽，其次是平菇和香菇，最少的是金針菇[24]。除此之外，食用菌不同部位的呈味肽含量也不相同，對于大多數食用菌來說，呈味肽在菌蓋中的含量大于菌桿中[9,23]。食用菌的生長周期也影響其呈味肽的含量，不論是香菇還是大褐菇，在生長初期，菌內鮮味和甜味肽的含量都是最多的，之后會呈遞減趨勢。但是食用菌的子實體多數是在成熟期開始采摘，成熟后，食用菌中呈味肽含量趨于平穩[23,25]。

自身帶有苦味和酸味的菌類通常被認為是有毒的而避免食用，一些藥用菌盡管苦味口感明顯，但仍被認為是可食用的。靈芝和云芝等藥用菌所含的疏水性氨基酸比例較大，而已發現的苦味肽中常含有這些氨基酸，所以苦味肽被認為是藥用菌口感苦澀的原因之一[15,26]。還有一些食用菌在酶解等加工過程中會被切割出含有苦味的肽，通常采用掩蓋或選擇性分離的方式脫苦，以達到品味標準[27]。

目前，關于食用菌中呈味肽的研究還處在初期，更多的研究集中在食用菌中游離氨基酸的呈味效果。同時，食用菌的滋味特征并不能完全反映食用菌中呈味肽的含量，除了呈味肽和呈味氨基酸之外，還存在其他呈味物質，如核苷酸、萜類和多糖等。所以針對食用菌呈味肽的研究應深入到其結構與滋味的表征關系。

2 制備食用菌呈味肽

食用菌因其良好的風味和豐富的蛋白質含量而受到關注，也是目前呈味肽來源研究的重點。消費者和商家主要關注食用菌的鮮味和濃厚感，所以食用菌鮮味肽和濃厚感肽的制備、分離純化和鑒定的研究具有重要意義。制備食用菌呈味肽的一般流程如圖1所示。

圖1 制備食用菌呈味肽的一般流程圖[5,9,28-29]Fig.1 General flowchart for the preparation of mushroom peptides[5,9,28-29]

2.1 制備食用菌呈味肽

制備食用菌中肽的方法主要有2種：制備食用菌水溶液提取物，然后直接獲得內源性肽；利用外源酶的水解作用，從分離的食用菌蛋白質中釋放肽片段[28]。

食用菌內源性呈味肽是食用菌生長過程中分泌出的肽[28]。在對華美牛肝菌中呈味肽提取鑒定的實驗中發現，當水料比為4∶1(mL∶g)，提取溫度45 ℃，4 ℃、2 000×g離心30 min，可得到溶出度最佳的呈味肽[30]。在食用菌呈味肽提取過程中，高壓蒸煮是常見的預處理方式，這與食用菌食用前的烹飪操作一致，高壓可以幫助菌類蛋白質釋放肽, 制備出更多小于500 Da的肽組分[7]。其他預處理方式對呈味肽提取同樣有效，沈健等[31]采用加熱、均質、超聲波和微波4種方法對香菇粉進行破壁處理，發現超聲波處理后可以得到更多的鮮味肽。

酶水解具有條件溫和、副產物少等優點，但由于酶具有專一性，且酶解過程中可能會產生一些不良風味，所以選擇合適的蛋白酶以及反應條件十分關鍵。KONG等[8]對比了中性蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、食用菌蛋白酶、纖維素酶等11種酶，發現中性蛋白酶對呈味蛋白的酶解效果最佳，可以從香菇中制備出更多呈味肽。菠蘿莖蛋白酶對谷氨酸和天冬氨酸有切割偏好，更適合釋放鮮味肽[24]。而相較于堿性蛋白酶，酸性蛋白酶水解蛋白后，可以留下更多疏水性氨基酸殘基，更適合釋放苦味肽[32]。除此之外，采用纖維素酶和風味蛋白酶分步操作可以制備出更多的草菇呈味肽[7]。對于不同的食用菌，不同酶或酶的組合效果不同。因此，篩選合適的酶仍然是制備呈味肽的第一步。

2.2 分離純化食用菌呈味肽

通常蛋白水解物純化的第一步是采用超濾(ultra filtration， UF)技術。由于食用菌鮮味肽的分子質量通常在3 kDa以下，李曉明等[6]選取了截留分子質量為3 kDa的UF離心管，獲得了所需要的白玉菇鮮味肽樣本。盡管這種技術可以顯著提高分離呈味肽的效率，但是很難獲得高純度的產品，因此UF處理后，產品還要進一步純化。

食用菌呈味肽的純化會聯合凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography， GFC)和反相高效液相色譜(reerse phase-HPLC, RP-HPLC)。GFC根據所選凝膠對混合物中各分子質量不同組分的阻滯作用不同進行分離，其具有適用性廣、分離速度較快的優點，但是不易分離分子質量接近的肽；而RP-HPLC基于肽混合物和固定相之間疏水性不同的分離原理，它的穩定性好、分離效率高，但受環境因素影響很大，且更適用于分子質量小的肽[33]。梁佳明等[9]和FENG等[5]都通過聯合GFC和RP-HPLC技術，分別從紅蔥牛肝菌和雙孢蘑菇中提取出純化的呈味肽。

2.3 鑒定食用菌呈味肽

由于質譜法具有高效、靈敏和重現性好的優點，不僅可以檢測出肽的分子質量，還可以確定肽的一級結構，已經被廣泛用于肽序列的鑒定。質譜的原理是將多肽轟擊成離子碎片，然后根據各碎片質荷比的不同進行分類和分析[33]。在對食用菌呈味肽的結構序列進行鑒定分析時，常常將液相色譜與質譜聯合應用，通過結合液相質譜的分離能力和質譜的分組分離能力，根據最終肽的結構特點和所含氨基酸殘基判斷其所屬的風味[6-7,9]。

目前食用菌呈味肽的呈味功能與其結構的關系尚不明確，所以通常在進行了質譜分析之后，還會進行感官評測，對食用菌呈味肽的具體風味進行確定，常用的2種方法是志愿者感官測評和電子舌。志愿者感官測評已經廣泛應用于各類食品。FENG等[5]采用志愿者感官評測最終確定了從雙孢蘑菇中制備的2種肽符合濃厚感肽的味道特性[5]。此法來鑒定食用菌呈味肽十分直接，但是大量的數據以及志愿者的不恰當描述會導致結果有所誤差。電子舌是一種味道傳感器，它通過化學傳感器矩陣和統計數據處理來模擬人類的感知，計算出的結果更精確。在對食用菌鮮味成分的感官分析中發現，電子舌的結果與人類感覺評價的結果顯著相關[29,34]。盡管如此，人體對于味道的感知受體和途徑并未完全了解，電子舌也不能夠完全代替人體感官評測，大多數時候還需要兩者結合來對食用菌呈味肽的風味進行鑒定。

3 食用菌呈味肽呈味機理

味蕾是味覺的外圍器官，由位于舌頭上的柱狀感覺細胞簇組成。味覺物質的分子識別發生在味蕾頂端的味覺感受器細胞，處于這里的受體賦予味覺刺激特異性，然后通過味覺神經傳遞，最終由大腦的味覺中樞表達[35]。哺乳動物常見的味覺感受器細胞有4種，分別是暗細胞(Type Ⅰ)、亮細胞(Type Ⅱ)、中間細胞(Type Ⅲ)和基細胞(Type I)，不同的細胞有不同的功能。暗細胞的占比最大，它與蛋白質和酶的轉運有一定關系；亮細胞是最主要的味覺識別傳導的細胞，它可以表達G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)，包含2種味覺受體，即1型味覺受體(type 1 receptor,T1R)和2型味覺受體(type 2 receptor,T2R)；中間細胞具有超微結構可識別的突觸；基細胞屬于增殖干細胞，可以分化出其他味覺細胞[36]。

如表2所示，食用菌呈味肽的呈味機理除了與受體特異性結合有關之外，還與氨基酸解離程度以及所含特殊陽離子、陰離子有關，且不同類型的呈味肽的呈味機理也有所不同。

表2 不同呈味肽的特征及其所對應的受體Table 2 Receptors and characteristics of different flaour peptides

甜味肽的受體被定義為C類GPCR，以T1R2和T1R3亞基的異源二聚體形式存在。根據夏倫貝爾的AH/B生甜學說，甜味肽的分子結構中有一個能形成氫鍵的基團—AH(如—NH2)和一個電負性的基團—B(如—COOH)，—B與—AH之間的距離大約在0.23～0.4 nm。同時甜味受體T1R2+T1R3也有一個類似的AH-B結構單元。甜味肽的AH-B結構單元與受體的AH-B結構單元結合后，會刺激味覺神經，從而產生甜的感覺[12]。除此之外，甜味肽的呈味效果還與所帶電荷和親疏水基團有關。當去除帶負電荷的殘基后，甜味會提高；反之去除帶正電荷的殘基后，甜味會下降。這可能是因為甜味受體上存在著帶負電荷的基團，可以與肽的正電荷側鏈形成鹽橋[37]。同時，疏水基團會因為掩蓋了受體的結合位點而使甜味下降[38]。

目前已知的苦味肽受體T2R有25種以上[39]。苦味肽的疏水性對苦味的呈現十分關鍵，它的疏水性主要由肽鏈中的氨基酸種類和序列決定，其中疏水氨基酸可以有效增強肽的疏水性來影響肽與受體的結合[40]?？辔峨谋徽J為像“鉤子”一樣附著在T2R受體上，從而將分子的疏水部分帶入受體細胞表面的網狀結合位點，之后形成受體-配體復合物來表達苦味[46-47]。藥用食用菌的苦味很明顯，除了一切常見的苦味物質外(如萜類)，疏水氨基酸的占比也很高，尤其是云芝，苦味氨基酸的含量高達8.42 mg/g(干重)[26]。

T1R1+T1R3異源二聚體是最早被認定的鮮味為受體，之后發現味蕾上還有2個親代謝型Glu受體mGluR4和mGluR1[36]。當鮮味肽具有帶負電、帶正電和疏水性的基團，且被鮮味受體N末端的捕蠅草結構域(enus flytrap domain,FTD)識別，才能呈現出鮮味[41-42,48]。紅蔥牛肝菌中提取的鮮味肽Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-Glu-Glu-Asn-Phe-Lys，前2個氨基酸殘基(Phe-Lys)可以看作帶正電荷的基團；中間5個氨基酸殘基(Asp-Leu-Gly-Glu-Glu)可以看作帶負電荷的基團；而末端3個氨基酸(Asn-Phe-Lys)可以看作弱疏水性的基團，其結構符合鮮味肽的特征[9]。

咸味肽呈味的關鍵是其電離出的陽離子，因為陽離子易吸附到細胞膜上的磷酸基上，隨后陽離子會經過細胞膜上的鈉離子通道(epithelial Na+channel ENaC)，繼而使Ca2+富集，細胞去極化，最后釋放信號傳遞至大腦使之產生咸味感覺。但要解釋人體對咸味的敏感性，還存在如瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential anilloid 1,TRP1)的通道[49-50,43]。

中間細胞可以識別酸味肽，而離子通道是酸味的傳遞者，其中瞬時受體電位陽離子通道(transient receptor potential cation channel, TRP)超家族的多囊腎病樣PKD1L3和PKD2L1是酸味肽的重要傳感器[44]。H+是一個重要的酸味信號傳導工具，所以酸味肽主要依靠酸性氨基酸殘基電離出的H+滲透到中間細胞，然后通過信號傳導，最終產生酸味[36]。

目前被認為是濃厚感肽受體的鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)存在于舌后部[45]。CaSR的激活劑主要是一些親水性的物質，由濃厚感肽激活CaSR的研究主要集中在γ-谷氨酰肽上。γ-谷氨酰肽與CaSR的胞外FTD結合，導致細胞去極化，釋放的ATP通過刺激味覺傳入神經上的ATP受體產生濃厚感的信號[20,44]。但CaSR似乎還與T2R共表達，且對鮮味也有一定潛在識別作用，所以CaSR是否對濃厚感的識別具有專一性還需進一步研究[21]。味覺受體示意圖如圖2所示。

圖2 味覺受體示意圖[20,36,43-44]Fig.2 Schematic diagram of taste receptors[20,36,43-44] 注：PLC-磷脂酶；IP3-三磷酸；cAMP-環磷酸腺苷

4 結論

呈味肽包括甜味肽、鮮味肽、苦味肽、咸味肽、酸味肽和濃厚感肽。它們的呈味效果與其所含的特定氨基酸殘基、親疏水性和陰陽離子有關，但具體定性定量的關系還未明晰，仍然在發掘階段。對于呈味肽呈味的機制，目前已經找到基礎的受體，但環境對呈味肽呈味效果的影響以及受體與呈味肽特殊結構之間的識別方式尚未研究，導致不少呈味肽的結構與其呈味機理并不完全相符。

食用菌富含高質量的蛋白質，且多數味道鮮美，是呈味肽的來源之一。目前，針對食用菌的呈味肽研究僅集中在鮮味肽，對于其他呈味肽的研究甚少，且缺少不同種類食用菌之間呈味肽含量和種類的對比，以及各種食用菌呈味肽提取方法之間的比較。食用菌呈味肽可能成為今后的熱點，還應該進行更深入的研究。