馬氏珠母貝黏液糖蛋白組成及其體外抗癌活性研究

歐陽彤，余 蔚，尚壯壯，任鼎鼎，伍 彬，2，鄭惠娜，2，3

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518108）

馬氏珠母貝（Pinctada martensii），又稱合浦珠母貝、珍珠母，是我國南海最重要的海水養殖珍珠貝類[1]。然而，產珠后的珠母貝貝殼、臟器及黏液等資源未獲得充分利用。為了進一步提高此部分資源的開發利用，增加珍珠產業的附加值，諸多學者對馬氏珠母貝產珠后的副產物進行了深入研究。司蕊等人[2]研究指出，馬氏珠母貝肉蛋白質含量豐富且必需氨基酸含量高，富含牛磺酸、微量元素鋅（Zn）和硒（Se）。葉植波等人[3]率先以馬氏珠母貝黏液為原料并從中提取出天然牛磺酸，為天然牛磺酸提取提供了新思路。課題組前期對馬氏珠母貝黏液糖蛋白的抗氧化活性進行了研究，結果表明馬氏珠母貝黏液糖蛋白對羥自由基有較強的清除能力[4]。此外，馬氏珠母貝貝肉所具有的抗衰老、抗氧化、降血壓、護肝醒酒、促進創面愈合等顯著生理功能活性作用的成分被一一驗證，闡明了馬氏珠母貝產珠后副產物的高附加值應用潛力[5]。

糖蛋白廣泛存在于生物體內，是一種由寡糖鏈與蛋白質共價結合所形成具有特定功能活性的一類結合蛋白，糖鏈結構為糖蛋白的功能核心，不同種類的寡糖鏈及與蛋白質的結合方式組成了生物體內酶、激素、凝集素、載體、抗體等，并且生物體中超過50%蛋白質具有糖基化修飾[6-8]。Go H等人[9]在研究糖蛋白過程中發現，從食物物料中通過分離手段得到的糖蛋白仍能表現出顯著的抗氧化、抗腫瘤生理活性，同時指出生物體內的糖蛋白可能具有功能的獨立性和穩定性。得益于生物組學、糖生物學和分離純化技術的發展，將生物體內糖蛋白提取純化后并進行結構鑒定和活性評價已成為了生物功效成分提取的新方向[10-11]。糖蛋白的來源分為植物源性與動物源性，由于植物源性糖蛋白提取中存在著藥理活性不確定因素，使得其在中藥材等方面的應用較局限，而動物源糖蛋白的提取多被作為提升實際生產過程中產生的副產物的附加值手段之一[12-13]。在打造“藍色糧倉”的當下，越來越多海洋生物源糖蛋白的生理活性被發現和驗證，徐偉良等人[14]以大鯢皮膚黏液為原料通過分離純化手段提取出了糖蛋白純品，并通過細胞試驗發現該糖蛋白具有顯著的抗肺癌活性。對馬氏珠母貝黏液糖蛋白進行分離純化、結構分析，并通過體外細胞試驗初步確定馬氏珠母貝黏液糖蛋白具有抗癌活性組分，研究結果為進一步提升馬氏珠母貝副產物附加值提供新思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝來源于廣東省雷州市珍珠貝養殖場，將黏液分離出來，于4℃下以轉速6 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于塑料瓶中，于-30℃下凍藏備用。Sephadex G-150柱層析，北京博奧拓達科技有限公司提供；美國USA進口透析袋，截留分子量為1 000 Da，上海橋星貿易有限公司提供；SDSPAGE凝膠快速配制試劑盒、彩色預染蛋白Marker（6.5～270 kDa）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 （5×）、SDS-PAGE電泳液（Tris-Gly，Powder）、考馬斯亮藍染色液，上海碧云天生物技術有限公司提供；MTT，上海源葉生物科技有限公司提供；南美胎牛血清、DMEM basic、0.25% Trpsin-EDTA，美國Gibco公司提供；Dimethyl sulfoxide，美國Sigma公司提供；乙二胺四乙酸二鈉鹽、二水、碳酸氫鈉、無水乙醇、氯化鈉、冰乙酸、D-無水葡萄糖、苯酚、硫酸、異丙醇、溴化鉀、二甲基亞砜，均為分析純。

1.2 儀器與設備

RC-6 plus型落地式高速冷凍離心機、ND 2000C型超微量紫外可見分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司產品；Advantage A10型超純水器，德國默克化工技術有限公司產品；Q10A型電陶爐，廣東新功電器有限公司產品；Quintix1102百分之一天平、Quintix224萬分之一天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司產品；Cool Safe 100-4型真空凍干系統，丹麥LABOGENE產品；HL-2型數字恒流泵、BS-100A型自動部分收集器，上海青浦滬西儀器廠產品；AP-9925型真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產品；KQ-500DE型數控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；Mini PROTEAN型電泳槽、Power Basic型電泳儀，美國BIO-RAD公司產品；NSP-300型水平旋轉儀，泰州諾米醫療科技有限公司產品；TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀，德國BRUKER公司產品；SQ510C型高壓滅菌鍋，日本YAMATO公司產品；DHG-9070A型精密鼓風干燥箱，中國BIOBASE公司產品；BC-J160型二氧化碳細胞培養箱、SW-CJ-FD型凈化工作臺、HHS-11-1型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司產品；DM0412型低速離心機，北京大龍興創實驗儀器股份公司產品；XD型細胞培養用顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產品；Synergy HT型酶標儀，美國BioTek公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬氏珠母貝黏液糖蛋白的粗提

將馬氏珠母貝黏液解凍，透析24 h，采用30%的聚乙二醇濃縮4 h，然后采用直接醇沉法對透析、濃縮后的馬氏珠母貝黏液進行粗提[5]，取適量黏液于燒杯中，加入90%的乙醇溶液至乙醇的體積分數為70%，緩慢攪勻后于4℃冰箱中靜置18 h，棄去上清液，將沉淀物于4℃下以轉速7 000 r/min離心15 min，取沉淀暴露在空氣中至乙醇味消散，真空冷凍24 h得糖蛋白粗品DAS。

1.3.2 糖蛋白的分離純化

采用Sephadex G-150柱層析法對透析、醇沉后的糖蛋白粗品進行分離純化[5]。層析柱規格為φ1.6 cm×60 cm；將糖蛋白粗品溶于超純水，于4℃下以轉速12 000 r/min離心10 min，過0.22 μm的水系微孔濾膜，調節可溶性蛋白含量為6～8 mg/mL，每次上樣4 mL。以質量分數0.05%的NaCl洗脫液為流動相，以1 mL/min的流速進行純化，每管收集5 mL，于波長280 nm處測定吸光度并繪制分離純化曲線，對出現的峰進行分開收集，真空冷凍干燥24 h，得糖蛋白純化品。

1.3.3 SDS-PAGE電泳

使用10%的分離膠和5%的濃縮膠，將膠板固定于電泳槽的凹槽內，使電泳膠完全浸泡于電泳液中，調整樣品蛋白質量濃度至1 mg/mL[5]，上樣10 μL，彩色預染蛋白分子量標準品上樣7 μL，調節電壓為120 V，電泳1～2 h，待條帶跑至電泳膠底部關閉電源，將電泳膠完整取出，振蕩染色2 h，脫色5～6 h至條帶清晰可見，將脫色后的電泳膠進行拍照，采用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件計算分子質量分布。

1.3.4 糖含量、氨基酸測定

總糖含量測定采用苯酚硫酸法[15-16]。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，吸光度（A） 為縱坐標，繪制標準曲線。測得標準曲線方程為Y=3.069X+0.062 4，R2=0.982 5。分別取0.5 mg/mL的粗品，0.3 mg/mL的純化品1.0 mL于2只試管中，按相同步驟測定吸光度，代入標準曲線計算樣品糖含量，見公式（1）：

式中：w——樣品的糖含量，%；

m1——樣品的糖的質量，g；

M——樣品有效成分的質量，g。

樣品水解氨基酸測定采用GB 5009.124—2016[17]。

1.3.5 紅外光譜測定

紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法[18]。取適量溴化鉀、糖蛋白純化品分開置于潔凈的玻璃皿上，放入紅外線快速干燥器烘2～3 h直至烘干，按糖蛋白樣品∶溴化鉀=1∶100的比例置于瑪瑙缽體中研磨成面粉狀且無晶體的細粉，用壓片機制成透光性良好的薄片，每種樣品設置3個平行，1組空白，采用傅里葉紅外光譜儀測定糖蛋白樣品的紅外圖譜。

1.3.6 糖蛋白的體外抗癌活性檢測

采用四氮唑藍還原（MTT）法測定糖蛋白對人肝癌細胞（HepG2）、小鼠肺癌細胞（LLC） 的抑制率。即細胞經傳代培養至倍數生長期后，制成細胞懸液，細胞計數后調節細胞濃度為5×104mL-1，種于96孔板，按質量濃度梯度設置3個平行，培養12 h待其貼壁后，加入一定質量濃度梯度的糖蛋白溶液，最終質量濃度梯度為0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mg/mL，作用24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL裂解液DMSO，小心振蕩10 min，在酶標儀上測定各孔在波長490 nm處的吸光度，按公式（2） 計算糖蛋白純化品對HepG2、LLC細胞的增殖抑制率，分析糖蛋白的生物活性作用。

1.3.7 試驗數據分析

數據采用Excel 2019軟件進行數據處理和繪圖，采用SPSS Statistics 26.0軟件進行方差（ANOVA）顯著性（p＜0.05） 以及回歸Probit分析。

2 結果與分析

2.1 Sephadex G-150柱層析法純化結果

珍珠貝黏液經過透析除鹽、乙醇沉淀后得到糖蛋白粗品，再通過Sephadex G-150進行分離純化，洗脫曲線在波長280 nm處呈現2個吸收峰，分別收集2個吸收峰的洗脫液，真空凍干后得糖蛋白純化品MP-FI、MP-FII。

DAS的Sephadex G-150柱層析洗脫曲線見圖1。

圖1 DAS的Sephadex G-150柱層析洗脫曲線

2.2 SDS-PAGE電泳圖譜分析

MP-FI和MP-FII的電泳圖見圖2。

圖2 MP-FI和MP-FII的電泳圖

由圖2可知，MP-FI在6.7，18.0，34.0，39.0，164.0 kDa處出現明顯的條帶，其中含量最高的蛋白組分分子量在39 kDa附近。與余蔚等人[4]研究得到的245 kDa糖蛋白分子量存在差異，可能是黏液批次和分離純化條件不同所導致。MP-FI中除了含量較高的39 kDa的蛋白組分，還含有其他雜蛋白，通過一步分離純化方法較難到單一的糖蛋白純化品。MP-FII在SDS-PAGE上形成的條帶較淡，可能含有分子量小于6.5 kDa的蛋白或其他低分子肽，其中較明顯的蛋白條帶出現在121 kDa附近。

2.3 糖含量、氨基酸組成分析

結構決定功能，糖肽鍵是由糖分子中碳原子上連接的醇羥基與氨基酸氨基脫水縮合或羥基脫去一分子水所形成，是糖蛋白的功能活性中心[19]。根據糖鏈與氨基酸連接方式和位點的不同可以將糖蛋白分為O-糖基化糖蛋白和N-糖基化糖蛋白，且可形成糖肽鍵的氨基酸殘基主要為天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Se）r、蘇氨酸（Th）r等，其中絲氨酸與蘇氨酸與糖鏈分子以O-連接方式連接，而天冬氨酸與糖鏈分子主要通過C-N共價連接方式進行連接[20-21]。試驗測得MP-FI有效成分的總糖質量分數為12.59%±0.34%，可溶性蛋白的質量分數為78.33%±5.30%；MP-FII有效成分的總糖質量分數為11.06%±0.15%，可溶性蛋白的質量分數為69.88%±5.27%。

氨基酸組成及百分含量（%，n=2） 見表1。

表1 氨基酸組成及百分含量（%，n=2）

由表1可知，MP-FI和MP-FII氨基酸種類豐富，均含有16種水解氨基酸，其中包含7種必需氨基酸：蘇氨酸（THR）、纈氨酸（VAL）、蛋氨酸（MET）、異亮氨酸（ILE）、亮氨酸（LEU）、苯丙氨酸（PHE）、賴氨酸（LYS），MP-FI和MP-FII中必需氨基酸的含量分別占水解氨基酸總量的36.86%和29.92%。近年來研究發現，具有抗癌活性的蛋白肽具有相似的賴氨酸、組氨酸及精氨酸的組成成分[22]。有研究發現癌癥細胞具有大量吸取必需氨基酸的特征[23-24]。

2.4 紅外光譜測定結果

采用傅里葉紅外光譜法對純品MP-FI、MP-FII的二級結構組成進行分析。

MP-FI、MP-FII的紅外光譜圖見圖3。

圖3 MP-FI、MP-FII的紅外光譜圖

由圖3可知，對比MP-FI與MP-FII 2種純化品的紅外光譜曲線，在酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）、酰胺III帶（1 220～1 330 cm-1）2種純化品存在明顯差異，說明MP-FI與MP-FII二級結構存在差異。其中MP-FI在1 653 cm-1處具有強特征吸收峰，說明其二級結構主要為α螺旋，根據Zhao Z K等人[25]在應用FTIR測定蛋白質結構中指出蛋白質分子中α折疊數量與分子內氫鍵數量呈正相關，可推測出MP-FI樣品分子結構中含有更多的氫鍵；同時，在1 541 cm-1處出現特征吸收峰代表在MP-FI中的N-H彎曲振動與C-N伸縮振動。MP-FII在1 647 cm-1處出現特征吸收，說明其二級結構中存在無規則卷曲，且MP-FII在1 456 cm-1出現特征吸收峰，代表著其結構內的C-H（O）C-O彎曲伸縮振動[26]。MP-FI、MP-FII在2 342，2 361，2 961 cm-1均出現吸收峰且頻率相似，說明2種純化蛋白具有相似的結構，而在3 296，3 422 cm-1處的吸收峰（O-H）、2 961 cm-1處的吸收峰（C-H） 和1 396 cm-1處的吸收峰（C-H）均為糖類的特征吸收峰，說明了MP-FI、MP-FII肽鏈結構存在差異，且MP-FI在1 040 cm-1處的吸收峰表示其糖鏈結構中存在β-型糖苷鍵結構[27]。

2.5 體外抗癌活性

MP-FI、MP-FII對HepG2的抑制率見圖4，MPFI、MP-FII對LLC的抑制率見圖5。

圖4 MP-FI、MP-FII對HepG2的抑制率

圖5 MP-FI、MP-FII對LLC的抑制率

由圖4可知，糖蛋白純化品MP-FI對人肝癌（HepG2） 細胞表現出明顯的增殖抑制作用。隨著質量濃度的增大，MP-FI對HepG2的抑制率逐漸增大，在1～4 mg/mL表現出明顯的劑量相關性（p＜0.05），當MP-FI質量濃度達6 mg/mL時，對HepG2的抑制率高達61.56%，IC50值為2.7 mg/mL。MP-FII在0.5～6.0 mg/mL質量濃度范圍內對HepG2的生長表現出一定的抑制作用，但無顯著性差異（p＞0.05）。由圖5可知，MP-FI對小鼠肺癌（LLC） 細胞表現出明顯的增殖抑制作用，在低質量濃度（0.5～2.0 mg/mL）范圍內無顯著性差異（p＞0.05），在2～6 mg/mL的質量濃度范圍內表現出明顯的劑量相關性（p＜0.05），當MP-FI質量濃度達6 mg/mL時，對LLC的抑制率達42.23%，IC50值為12.1 mg/mL。總體分析可知糖蛋白純化品MP-FI的抗癌活性明顯強于MP-FII（p＜0.05）。

細胞大量積累自由基是導致其發生癌變的主要原因之一，且研究發現，發生癌變的細胞內含有更多的自由基，而這些自由基通過損傷細胞內部的DNA使正常良性腫瘤細胞進一步發展成為惡性癌細胞，具有清除自由基的物質能夠對癌細胞產生抗性作用[28]。在前期的研究中，證實了馬氏珠母貝黏液糖蛋白具有顯著的抗氧化清除自由基的能力[5]，MP-FI與MP-FII對2種癌細胞的抑制作用可能與其所具有的體外抗氧化活性密切相關。

3 結論

MP-FI和MP-FII含有的氨基酸種類豐富，含有較高的與抗癌功能活性相關的賴氨酸和精氨酸。MP-FI的分子量分布集中為6.7～39 kDa。MP-FI、MP-FII的化學結構與化學組成存在差異，且根據MP-FI特征吸收峰確定了其存在區別于MP-FII的α螺旋二級結構，MP-FI和MP-FII均具有多糖的特征吸收峰，其中MP-FI中具有β-型糖苷鍵的結構。MP-FI、MP-FII均具有一定的抗癌活性，且MP-FI對HepG2、LLC的抑制作用明顯高于MP-FII。研究結果可為進一步利用馬氏珠母貝黏液開發具有抗癌活性功能的制品提供理論基礎依據。