云南重樓ITS序列單核苷酸多態性與甾體皂苷特征的相關性分析

尹鴻翔，張開元，任梓萱，趙家雯，蔣桂華, 陳蓉*

云南重樓ITS序列單核苷酸多態性與甾體皂苷特征的相關性分析

尹鴻翔1，張開元2，任梓萱1，趙家雯1，蔣桂華1, 陳蓉1*

(1.成都中醫藥大學民族醫藥學院，成都 611137；2. 四川新綠色藥業科技發展有限公司，四川 彭州 611930)

為了解云南重樓(var.) ITS序列的單核苷酸多態性(SNP)特征與其甾體皂苷構成特征的相關性，并探討其對藥材質量穩定性的影響，利用MegAlign軟件對37份云南重樓樣本的ITS序列進行對比，根據SNP位點進行分型；采用HPLC法測定7種甾體皂苷成分(重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和薯蕷皂苷)；用SPSS 25.0軟件和SIMCA-P 15.0軟件對各基因型甾體皂苷構成特征進行統計分析。結果表明，云南重樓ITS序列存在40個雙等位多態性位點，其中堿基轉換32個，堿基顛換8個，根據SNP特征可劃分為2類基因型YN-I和YN-II。6種甾體皂苷(重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H、薯蕷皂苷)在云南重樓廣泛分布，而重樓皂苷Ⅴ稀少。YN-I和YN-II的藥典指標成分總含量分別為1.070%和0.93%，樣本合格率分別為68.42%和77.78%；YN-I的甾體皂苷總含量為1.65%，YN-II為1.32%。方差分析表明，2類基因型的甾體皂苷特征存在一定程度的區別，但藥典指標成分無顯著差異，藥材應該具有等效性。聚類分析和主成分分析表明，YN-Ⅰ的離散度更高，YN-Ⅱ的聚集度更好，表明YN-II的藥材質量更加穩定，植株個體的甾體皂苷合成和累積差異更小，YN-II的SNP特征對云南重樓良種選育的分子遺傳標記篩選具有重要意義。

云南重樓；ITS；單核苷酸多態性；基因型；甾體皂苷

云南重樓(var.)是重樓屬的多年生草本植物，又名滇重樓，與七葉一枝花(var)共同作為中藥重樓的法定基原，收載于《中國藥典》[1]。云南重樓主產于我國西南地區，隨著重樓栽培產業的發展，因其優良的藥材質量，成為主要的栽培種源[2]。中藥材DNA條形碼研究表明云南重樓種內遺傳變異豐富, ITS序列存在明顯的單核苷酸多態性(single nucleo- tide polymorphism, SNP)[3–4]，并由此劃分為2種基因型(YN-I和YN-II)。為了避免2種基因型并存導致真偽鑒定結果出現“假陰性”，開發了同時鑒別2種基因型的多重PCR鑒別體系[4]。

然而，目前尚無報道云南重樓ITS序列的SNP現象是否會引起植株在化學成分構成上的分化，進而在種內衍生出不同的化學型？研究這一問題對于豐富云南重樓種質資源多樣性具有重要意義，并可能發現具有篩選價值的分子遺傳標記。同時，根據2018年國家藥品監督管理局發布的《中藥材生產質量管理規范》(征求意見稿)的要求，中藥材的優良品種選育，禁用人工選育的多倍體或者單倍體品種、種間雜交品種和轉基因品種。因此，從云南重樓野生種群的自然變異類群中優選良種，將是未來重樓育種的主要途徑，探索ITS區的SNP現象與藥材質量的關聯性將為實現這一目標提供重要參考。

本研究對云南重樓YN-I和YN-II型植株進行田間觀察，發現形態學特征并無明顯的分化[4]。為進一步了解是否會引起植株化學型的分化，進而影響藥材質量，本研究收集了云南重樓不同產區的樣品，根據其ITS序列的SNP特征進行基因型的鑒別，然后對不同基因型的7種甾體皂苷類成分(重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、薯蕷皂苷)進行測定，分析基因型與甾體皂苷構成的相關性，探討其對藥材質量的影響，為云南重樓的質量控制和良種選育提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

云南重樓樣本共37份，分別于2019—2021年采自云南、貴州、四川3省的主產區，根據采集年月編號憑證標本，樣本詳細信息見(表1)。樣品經成都中醫藥大學尹鴻翔副教授進行原植物鑒定，根據李恒系統，均符合云南重樓的特征(圖1)；再經ITS序列同源性比對鑒定為云南重樓(var.)，憑證標本藏于成都中醫藥大學標本館(CDCM)。

1.2 儀器和試劑

Legend Micro 21R離心機(美國Thermo); BSA 124S分析天平(Sartorius科學儀器有限公司); MK-10干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；PCR儀(杭州博日科技有限公司)；DDY-12電泳系統(北京六一儀器廠)；激光成像儀Typhoon 7000 (通用電氣醫療集團生命科技部)；微量紫外-分光光度儀(Thermo Nanodrop 2000)。Agilent technologies 1200series 高效液相色譜儀(DAD檢測器)，色譜柱COSMOSIL Cholester RP-C18 (4.6 mm×250 mm, 5m)，BP121S電子分析天平(萬分之一)，ULUP-I-10T優普超純水機(成都超純有限公司)，SB-5200D超聲波清洗器(寧波新藝超聲設備有限公司)，SHZ-DⅢ型循環水式多用真空泵(上海一科儀器有限公司)，BCD-202D型冰箱(北京海信電器)，DTF-100A型手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司), 101-3- BS型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械有限公司)。

表1 云南重樓樣品

續表(Continued)

圖1 云南重樓。A: YN-I型；B: YN-II型。

瓊脂糖(廣州賽國生物科技有限公司)，Goldview I型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，EasyDNA聚合酶，10×EasyBuffer (Mg2+plus) (北京全式金生物技術有限公司), DNA Marker-B, dNTPs Mixture Solution (生工生物工程股份有限公司)，植物組織DNA提取試劑盒(成都福際生物技術有限公司)，-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。色譜純乙腈(TEDIA)，超純水，分析純乙醇為(Fisher), 重樓皂苷I (批號：111590-201604，純度93.6%)、Ⅱ (批號: 111591-201103, 純度93.4%)、Ⅵ (批號：111592- 201604, 純度98.0%)、Ⅶ (批號: 111593-201604, 純度94.0%)均購自于中國食品藥品檢定研究院；薯蕷皂苷(批號：19057-60-4)購于上海甄準生物科技有限公司。重樓皂苷H (純度98.3%)、Ⅴ (純度97.1%)由本課題組制備[5]。

1.3 單核苷酸多態性分析

參照張開元等[4]的方法，采用ITS序列通用性引物ITS-4/ITS-L對37份樣本進行擴增，擴增產物送成都擎科梓熙生物科技有限公司測序，利用Megalign軟件對測序結果進行校對與分析，找出具有穩定差異的SNP位點，然后進行基因分型。

1.4 甾體皂苷構成特征分析

采用李朋等[5]的方法，對37份樣品的7種甾體皂苷含量進行測定，平行測定3次，取平均值，完成定性、定量對比分析。根據《中國藥典》一部重樓項下含量測定標準[1]進行合格率評價。

1.5 聚類分析和主成分分析

采用SPSS 25.0基于平均聯結(組間)譜系圖法對樣本的甾體皂苷構成特征進行聚類分析(CA)，采用SIMCA-P 15.0軟件進行主成分分析(PCA)。

2 結果和分析

2.1 SNP和基因型劃分

采用Megalign軟件對37份樣本的ITS序列進行校對，擴增的ITS序列包含ITS1、5.8s rDNA和ITS2等3個片段。SNP有40個位點，其中ITS1區有SNP位點18個，5.8s rDNA區1個，ITS2區21個。40個位點均為雙等位多態性，其中發生堿基轉換的有32個，堿基顛換的有8個(表2)。依據SNP位點多樣性可以劃分為2種基因型，分別編號為YN-I和YN-II，其中YN-I型有19份(1～19號)，YN-II型18份(20～37號)。

表2 云南重樓ITS區的SNP位點特征

灰色底紋為堿基顛換，其余為堿基轉換。

Gray shading indicate base transversion and the rest indicates base transition.

2.2 甾體皂苷構成特征分析

以7種甾體皂苷對照品的進樣量(g)為橫坐標，色譜峰峰面積(A)為縱坐標，繪制對照品的標準曲線，擬合回歸方程。7種甾體皂苷色譜峰面積的RSD為0.316 5%～1.261 4%，表明方法的精密度良好; 重復性試驗的RSD為0.613 6%～2.115 5%，表明重復性良好；且對照品和供試品溶液中7種甾體皂苷在24 h內基本穩定；7種甾體皂苷的平均加樣回收率為99.71%～99.60%，均符合測定要求。

37份樣品的測定結果見表3，7種甾體皂苷對照品、YN-I型和YN-Ⅱ型的HPLC特征見圖2。根據2020年版《中國藥典》一部重樓項下規定，重樓皂苷I、II、VII之和不少于0.6%評價合格率。從表3可見，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H和薯蕷皂苷等6種甾體皂苷在云南重樓中廣泛分布，但重樓皂苷V較稀少，37份樣品中僅有8份出現。除樣品1、2、3、4、5、6、24、28、31和34外，其余27個樣品均達到《中國藥典》的含量標準，整體合格率達72.97%，其中YN-Ⅰ型的合格率為68.42%,YN-Ⅱ型為77.78%。YN-I型的藥典指標成分總含量平均為1.070%，YN-II型為0.93%; YN-I型的7種甾體皂苷總含量平均為1.65%，YN-II型為1.32%。以基因型為影響因素，進行單因素方差分析(One- Way ANOVA)，結果表明YN-I型和YN-II型的藥典指標成分含量無顯著差異(>0.05)，但7種甾體皂苷總含量有顯著差異(<0.05)，說明2類基因型的甾體皂苷構成存在一定的分化。

2.3 聚類分析

采用SPSS 25.0軟件對37批樣品的甾體皂苷構成特征進行聚類分析，構建樹狀聚類圖(圖3)。當相似性距離為5～10時，37個樣品聚為4支，其中Ⅰ-14、Ⅰ-15聚為第1支(A)；Ⅰ-8、Ⅰ-18、Ⅰ-19聚為第2支(B)；Ⅱ-8獨立成第3支(C)；其余31個樣品聚為第4支(D)。第4支成員眾多，當相似性距離<5時明顯分為2個亞支，Ⅰ-16、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-11、Ⅱ-16和Ⅱ-18聚為一亞支(D-1)，其中YN-Ⅰ型1個和YN-Ⅱ型5個；其余25個樣品聚為另一亞支(D-2)，包括YN-Ⅰ型13個和YN-Ⅱ型12個。可見，不同基因型的樣品可以聚類到同一分支中(如D-1和D-2)。

圖2 云南重樓和對照品HPLC圖。A: 7種甾體皂苷對照品; B: YN-I型; C: YN-II型; 1: 重樓皂苷VII; 2: 重樓皂苷H; 3: 重樓皂苷VI; 4: 重樓皂苷II; 5: 薯蕷皂苷; 6: 重樓皂苷I; 7: 重樓皂苷V。

表3 樣品的甾體皂苷成分含量

續表(Continued)

產地對甾體皂苷構成特征具有一定程度的影響，A支的Ⅰ-14、Ⅰ-15均來自貴州六枝；Ⅱ-8是唯一的單獨產地樣品(四川德昌)，獨立成C支；Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6和Ⅱ-5雖然分屬2個基因型，但均來自貴州長順而聚在一起。

2.4 主成分分析

采用SIMCA-P 15.0軟件對37份樣品的甾體皂苷含量進行主成份分析(PCA)，標定了3個主成份, 分別繪制了基于2個主成分的二維得分圖(圖4: A)和基于3個主成分的三維投影圖(圖4: B)。從圖4可見，37個樣品的甾體皂苷成分構成特征雖無明顯的基因型分化，但仍然表現出一定程度的影響，圖3中聚在一起的Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6和Ⅱ-5等4份樣品在圖4: A中出現了分化，前三者仍然聚為一簇，但和II-5明顯分離。另外，YN-Ⅰ樣品的離散度較高，而YN-Ⅱ樣品的聚集度更好，其中Ⅰ-8號和Ⅰ-18號樣品在Hotelling’s T2 (95%)下甚至表現為強異常值；這一特征也進一步在圖4: B的三維投影圖中得到體現。

同時，地理位置對甾體皂苷構成特征同樣表現出一定影響，在圖4: A中，Ⅰ-1、Ⅰ-2和Ⅰ-3號樣品(均來自貴州興義)明顯聚集，Ⅰ-4、Ⅰ-5和Ⅰ-6號樣品(均來自貴州長順)明顯聚集，和圖3的聚類分析結果一致；Ⅱ-12、Ⅱ-13和Ⅱ-14 (均來自云南宣威)明顯聚集，在圖4: B中，單一產地樣品Ⅱ-8 (四川德昌)明顯偏離其他樣品，也和圖3的聚類結果一致。

圖3 基于甾體皂苷特征的聚類圖

3 結論和討論

重樓栽培種的種內甾體皂苷特征被相繼報道[5–6], 對云南重樓的種內變異研究涉及了分子遺傳標記、形態學特征及其與甾體皂苷類成分的關聯性[7–11],然而遺傳多樣性與甾體皂苷特征的相關性卻未見報道。本研究首次報道了云南重樓ITS序列的SNP特征和甾體皂苷類成分的相關性。結果表明，重樓皂苷Ⅴ的分布稀少，與吳鈺穎等[12]的報道相似，這應該是重樓皂苷V沒有納入《中國藥典》含量指標的原因之一。2個基因型在《中國藥典》合格率上有一定差異，YN-Ⅱ型>YN-Ⅰ型，但是7種甾體皂苷總含量上YN-Ⅰ型卻顯著大于YN-Ⅱ型。二者在這兩項指標的不同反差提示，YN-Ⅱ型在甾體皂苷合成與累積方面個體差異小，更加穩定一致。PCA分析表明，YN-Ⅱ樣品的聚集度更好，YN-Ⅰ樣品的離散度更高，也印證了上述推測。究其原因，雖然絕大多數SNP存在于非編碼區(ITS1和ITS2)，但5.8S rDNA區的SNP卻可能會影響核糖體的轉運功能，進而影響甾體皂苷累積的穩定性。這是否對已知的甾體皂苷合成途徑及關鍵酶基因的表達產生影響，如甲羥戊酸途徑(MVA)[13–14]、鯊烯合酶(SQS)[15]、鯊烯環氧酶(SE)[16]、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MVD)[17]、環阿屯醇合酶(CAS)[18]、細胞色素P450單加氧酶[19]等,還需要進一步驗證。另外，參考華重樓基因組結構[20]對2類基因型的葉綠體基因組進行分析，探討光合作用效率是否影響皂苷合成也是一個探索方向，在云南重樓良種選育的遺傳標記篩選中具有獨特價值。

圖4 主成分分析。A: 二維得分圖; B: 三維投影圖。

相對于基因型，地理位置對甾體皂苷構成特征具有更明顯的影響，出現了3類現象：(1) 產地相同的樣品聚在一起，甚至單獨產地樣品獨立成一支(如Ⅱ-8)；(2) 不同產地樣品聚在一起；(3) 相同產地樣品不聚在一起。究其原因，甾體皂苷作為次生代謝產物，其合成與累積也受到環境因子的調控, 相同的地理位置往往具有相似的生態環境，導致相似的化學特征，因此聚在一起，特殊生境的植株甚至獨立成支。同理，不同產地的植株若小生境相似，也可能聚在一起；反之，產地相同但是小生境差異較大，植株化學特征則必然分化[21]。這提示，地理位置及其小生境對于甾體皂苷構成具有明顯的影響，為保證重樓藥材質量穩定，一定要選擇生態適宜區并保持種植地的小生境一致。

綜上，云南重樓YN-Ⅰ型和YN-Ⅱ型的甾體皂苷構成特征存在一定程度分化，但藥典指標成分仍無顯著性差異，二者在生產、監管和臨床使用上不必區分對待。YN-Ⅱ型植株甾體皂苷累積的個體差異小，其SNP標記對于云南重樓的良種選育具有明顯意義。雖然YN-I型的合格率較低，但是平均總皂苷含量更高，在重樓總皂苷的生產中可作為優良的提取原料。

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Correlation Analysis Between Single Nucleotide Polymorphism of ITS Sequences and Profile of Steroidal Saponins Composition ofvar.

YIN Hongxiang1, ZHANG Kaiyuan2, REN Zixuan1, ZHAO Jiawen1, JIANG Guihua1, CHEN Rong1*

(1. College of Ethnomedicine, Chengdu University of Tradition Chinese Medicine,Chengdu 611137, China; 2.Sichuan Neo-Green Pharmaceutical Technology Development Co. Ltd.,Pengzhou 611930, Sichuan,China)

In order to understand the correlation between characters of single nucleotide polymorphism (SNP) of internal transcribed spacer (ITS) sequences and composition of steroidal saponins ofvar.the effect of SNP on the quality stability of medicinal materials, the ITS sequences of 37 samples were compared by MegAlign, and then classified according to SNP loci. In addition, 7 steroidal saponins (polyphyllin Ⅰ, Ⅱ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, H, dioscin) in samples were determined by HPLC-DAD. The steroidal saponin composition characteristics of each genotype were statistical analysis by SPSS 25.0 & SIMCA-P 15.0.The results showed that there were 40 double-allelic polymorphic sites in ITS sequences ofvar., including 32 base conversion sites and 8 base inversion sites. According to SNP characteristics, 37 samples were divided into two genotypes: YN-I and YN-II. Six kinds of steroidal saponins (polyphyllin Ⅰ, Ⅱ, Ⅵ, Ⅶ, H, dioscin) were widely distributed in samples, while polyphyllin Ⅴ was relatively rare. The mean total content of pharmacopoeia index components inYN-I and YN-II were 1.070% and 0.93%, which the sample pass rate were 68.42% and 77.78%, respectively. The mean total content of 7 steroidal saponins were 1.65% and 1.32%, respectively. ANOVA analysis showed that there was significant differentiation of steroidal saponins profile between two genotypes, while there was no significant difference in the index components of pharmacopoeia, so the medicinal value of two genotypes should be equivalent. Cluster analysis (CA) and principal component analysis (PCA) showed the dispersion of YN-I was higher than that of YN-II, indicating the quality of medicinal materials of YN-II was more stable and the individual differences in steroidal saponins synthesis and accumulation in YN-II was smaller than YN-I. Therefore, the SNP characteristics of YN-II were of great significance for the screen of molecular genetic markers in the breeding ofvar..

var.; ITS; Single-nucleotide polymorphism; Genotypes; Steroidal saponin

10.11926/jtsb.4494

2021-08-05

2021-11-05

國家自然科學基金項目(81573545)；成都市科技局技術創新研發項目(2019-YF05-00346-SN)；成都中醫藥大學杏林學者學科人才計劃項目(QNXZ2018039)資助

This work was supported by National Sciences Foundation of China (Grant No. 81573545); the Project for Technology Innovation and Research and Development of Chengdu Science and Technology Bureau (Grant No. 2019-YF05-00346-SN); and the Program for Apricot Grove Scholars of Chengdu University of TCM (Grant No. QNXZ2018039).

尹鴻翔，男，博士，副教授，研究方向為中藥及民族藥資源可持續利用及質量評價。E-mail: hongxiangy@126.com

. E-mail: 498064364@qq.com