地塞米松治療槍彈傷致兔開放性骨缺損合并海水浸泡的實(shí)驗(yàn)研究

陳肖松，張淦，劉勝杰，馬武秀，陳聰聰，吳成如

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院，1.骨一科；2.骨二科，安徽合肥 230031)

骨缺損是戰(zhàn)爭中常見的損傷，火器傷導(dǎo)致的骨缺損因局部組織血運(yùn)遭到嚴(yán)重破壞導(dǎo)致無法獲取充足的氧氣和營養(yǎng)，常出現(xiàn)延遲愈合。海戰(zhàn)及登陸作戰(zhàn)時(shí)，骨缺損常伴有海水浸泡，海水含多種致病菌，其還有滲透壓高以及高堿性的理化特點(diǎn)，影響受損組織的修復(fù)[1,2]。本研究制作火器傷致兔開放性骨缺損合并海水浸泡的動(dòng)物模型，經(jīng)靜脈注射地塞米松治療，旨在觀察其效果，并分析其中的機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及其相關(guān)分組

選擇56只日本大耳家兔(安徽醫(yī)科大學(xué)提供)，體重(2.5±0.43)kg。按隨機(jī)數(shù)字表法，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為A、B兩組各28只，A組為空白對照組，B組為地塞米松治療組。每組分為1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周7個(gè)亞組，每亞組4只兔子。

1.2 設(shè)備及儀器

人工海水由海鹽配制(國家海洋局第三研究所提供)。MDA、SOD試劑盒，Olympus光學(xué)顯微鏡(日本)，Pixel LINK 1394 Camera顯微鏡(美國)。超聲破碎儀，離心機(jī)，紫外可見光分光光度計(jì)。槍支及彈丸指標(biāo)：中國東風(fēng)速射運(yùn)動(dòng)手槍SS04型，口徑為5.6 mm，初速(V10)210～240 m/s，使用直徑5.6 mm槍彈。

1.3 方法

(1)動(dòng)物手術(shù)方法：將20%烏拉坦(4 mg/kg，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，國藥準(zhǔn)字Q31/0106000055c444-2020，批號：20210907)通過耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定于支架上，隨機(jī)選擇單側(cè)后肢對準(zhǔn)股骨中段進(jìn)行槍擊，槍口距離20 cm，造成股骨開放性骨缺損，傷后患肢均行簡單固定及包扎，將傷肢浸泡于人工海水1 h，水溫控制在21℃，室溫25℃。A組(對照組)：行常規(guī)清創(chuàng)+股骨復(fù)位內(nèi)固定術(shù)，一期閉合傷口。B組(地塞米松治療組)：行常規(guī)清創(chuàng)+股骨復(fù)位內(nèi)固定，一期閉合傷口，立即于靜脈注射地塞米松注射液(5 mg/kg，山東辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H37021969，批號：2108302212)。所有動(dòng)物均置于動(dòng)物房中飼養(yǎng)，青霉素粉針劑(華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020657，批號：F1042106)40 WU肌肉注射1次/d×3 d，定時(shí)換藥，傷后愈合后拆線。

(2)取材與石蠟切片制作：各亞組于術(shù)后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周各取4只兔，取各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物骨缺損周圍組織100 mg，移入玻璃勻漿器中，加1 mL勻漿介質(zhì)，使組織勻漿化。將漿液放入離心管中，4000 rP/min離心10 min，棄上清液，加入預(yù)冷的0.05 mol/L pH為7.8的磷酸緩沖液，0～4 ℃下超聲波破碎, 破碎液在10000 rP/min的4℃離心機(jī)中離心30 min，上清液即為粗酶液，-20℃保存?zhèn)溆?。另外，于傷肢股骨骨缺損處截取標(biāo)本，10%的甲醛處理標(biāo)本，固定24 h，硝酸溶液脫鈣，制成石蠟切片，厚度5 μm。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)一般情況的觀察：實(shí)驗(yàn)用兔子是否存活，傷口是否感染等。

(2)影像學(xué)觀察：傷后4周、8周、12周，實(shí)驗(yàn)兔在麻醉后行X線攝片，觀察槍彈傷造成傷肢股骨骨折及骨缺損的愈合情況，并經(jīng)相關(guān)儀器測得骨缺損部位的骨痂灰度值。灰度值測定方法：在X線機(jī)下拍攝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患肢正側(cè)位片，隨機(jī)于膠片上骨缺損區(qū)域取3個(gè)相應(yīng)觀測點(diǎn)，用相關(guān)圖像軟件(Photoshop cc2021)分析各點(diǎn)骨痂灰度值，并取其平均數(shù)值作為指標(biāo)。

(3)組織學(xué)觀察：骨標(biāo)本脫鈣、制作石蠟切片、H-E染色后，光鏡下觀察骨折處肉芽組織、纖維組織、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等生長情況。

(4)動(dòng)物標(biāo)本骨缺損周圍組織中MDA含量、SOD活力測定：MDA含量采用TBA比色法測定，吸取離心的上清液0.2 mL和1.8 mL蒸餾水(對照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL的0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再在4000 rP/min下離心10 min。取上清液測定532 nm波長下的消光度，用比濃度表示MDA(nmoL/mg)含量。SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，取上清液，按照試劑盒說明書配制相應(yīng)溶液，在560 nm波長下測定各管的OD值，計(jì)算SOD活性。用比活力表示SOD(U/mg)活力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活，傷口無明顯感染，均愈合，予以拆除傷后縫線，骨缺損臨床愈合后，動(dòng)物活動(dòng)能力良好。

2.2 影像學(xué)觀察

術(shù)后4周A、B兩組骨缺損區(qū)有薄云狀骨痂陰影，術(shù)后8周兩組骨缺損部位組織陰影較4周時(shí)增強(qiáng)，少部分外骨痂形成板層狀或梭形且規(guī)則。術(shù)后12周，兩組動(dòng)物骨缺損處均形成骨性連接，但髓外皮質(zhì)尚未完全塑性，部分動(dòng)物的髓腔未完全再通(見圖1)。A組及B組動(dòng)物骨缺損區(qū)在不同時(shí)間點(diǎn)的平均骨痂灰度值見表1，A、B兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 傷后4、8、12周動(dòng)物傷肢X線片觀察

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨缺損區(qū)域X線片平均骨痂灰度值

2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后第1天，A組挫傷區(qū)肌纖維大片壞死，部分區(qū)域組織僅見一些殘存的結(jié)締組織和少量肌組織碎片，伴有大量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)血管淤血，大量出血。震蕩區(qū)發(fā)生大片繼發(fā)性肌變性壞死，肌纖維排列紊亂，間質(zhì)嚴(yán)重水腫、淤血，有中等量炎細(xì)胞浸潤，灶性出血。B組標(biāo)本各區(qū)炎癥反應(yīng)、水腫程度及范圍方面均較A組減輕。術(shù)后4周，A、B組均以纖維組織增生為主，未見明顯軟骨組織增生，偶見骨樣組織形成，可見少許血管增生。術(shù)后第8周，A、B兩組可見少量軟骨細(xì)胞，骨樣基質(zhì)形成，未見不規(guī)則骨小梁。術(shù)后12周，A、B組少量成熟板層骨，不規(guī)則骨小梁形成，骨小梁窄細(xì)、稀少，部分髓腔內(nèi)未見骨小梁。術(shù)后兩組成骨質(zhì)量無明顯差別(圖2)。

HE染色×100

2.4 動(dòng)物標(biāo)本骨缺損區(qū)域MDA含量以及SOD活力測定

傷后1 d、3 d、7 d、2周、4周時(shí)，A組標(biāo)本中MDA含量顯著高于B組，SOD活性顯著低于B組(P<0.05)；而在8、12周時(shí)，兩組標(biāo)本中MDA含量及SOD活力無明顯差異(P>0.05)，見表2-3。

表2 兩組傷后骨缺損區(qū)域各時(shí)相點(diǎn)MDA含量比較(nmol/mg)

表3 兩組傷后骨缺損區(qū)域各時(shí)相點(diǎn)SOD活力比較(U/mg)

3 討論

由于特殊的作戰(zhàn)環(huán)境，參加海戰(zhàn)及登陸作戰(zhàn)的傷員在傷后常伴有長時(shí)間的海水浸泡?；鹌鱾?jīng)海水浸泡后，會(huì)明顯增加傷員的死亡率和致殘率，并對指戰(zhàn)員士氣造成重大影響，降低部隊(duì)的戰(zhàn)斗力，無法有效完成作戰(zhàn)任務(wù)，是后勤醫(yī)療保障部門必須重視和解決的難題[3]。

與淡水相比較，海水滲透壓高、含堿量高，同時(shí)攜帶多種細(xì)菌，是一種中等濃度的強(qiáng)電解質(zhì)溶液[4]。損傷的機(jī)體經(jīng)海水浸泡后，可導(dǎo)致機(jī)體高滲性體液轉(zhuǎn)移，從而引起微循環(huán)供血的缺乏，組織如果出現(xiàn)缺血缺氧的狀態(tài)，氧自由基及超氧化物的聚集可誘發(fā)過氧化脂質(zhì)反應(yīng)[5]，產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞，刺激多種炎癥因子釋放，激活體內(nèi)氧化應(yīng)激系統(tǒng)，導(dǎo)致病情進(jìn)一步發(fā)展，最終致受損組織周圍血管通透性增大，間質(zhì)水腫，反復(fù)惡性循環(huán)、嚴(yán)重?fù)p傷機(jī)體組織[6,7]。根據(jù)研究表明，動(dòng)物肢體被火器致傷、再經(jīng)海水浸泡后，機(jī)體組織受到的傷害會(huì)更加嚴(yán)重[8,9]。本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物肢體火器傷浸泡于人工海水后，病理切片光鏡下觀察顯示，A、B兩組動(dòng)物的患肢傷道周圍均出現(xiàn)原發(fā)傷道區(qū)、挫傷區(qū)及震蕩區(qū)，部分肌纖維斷裂，變性壞死，間質(zhì)輕度水腫，血管淤血，各區(qū)均有不同程度的炎細(xì)胞浸潤。該結(jié)果與相關(guān)海水浸泡傷研究中組織損傷的表現(xiàn)一致[10,11]。

地塞米松具有抗炎、抗過敏等多種功能，在創(chuàng)傷后的自由基生成和脂質(zhì)過氧化的抑制等方面得到了廣泛的應(yīng)用[12-14]。地塞米松可以增加肺組織中PaO2的濃度，減輕肺組織的損害，并能抑制肺組織中SOD活性及TNF-α、IL-1β、IL-8的表達(dá)，從而降低肺組織中嗜酸性白細(xì)胞的侵襲和激活[15]；另一項(xiàng)研究顯示，地塞米松可減輕感染后大鼠肺組織的水腫，降低肺組織MDA含量、MPO活力、增強(qiáng)SOD活力、抑制自由基和脂質(zhì)過氧化，從而減輕對小鼠的傷害，降低死亡率，證明了地塞米松具有抗炎癥的作用[16]。MDA是一種重要的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，其作用機(jī)制是通過對線粒體呼吸鏈復(fù)合體和線粒體關(guān)鍵酶的合成，從而通過MDA的濃度來間接地反映細(xì)胞損傷。SOD是一種存在于生物體中的抗氧化金屬酶，能促進(jìn)氧自由基的自由基歧化，產(chǎn)生氧和過氧化氫，SOD的活力是反映人體自由基代謝狀況的一個(gè)重要指標(biāo)，對機(jī)體的氧化、抗氧化平衡有重要影響，SOD的水平可間接地反映機(jī)體對自由基的清除能力。本實(shí)驗(yàn)中，傷后第1天，A組動(dòng)物組織損傷嚴(yán)重，伴有大量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)嚴(yán)重水腫、淤血，炎癥反應(yīng)明顯；B組經(jīng)地塞米松治療后，標(biāo)本中可見炎癥反應(yīng)、水腫程度及范圍方面均較A組減輕，同時(shí)傷后1 d、3 d、7 d、2周、4周時(shí)，A組標(biāo)本中MDA高于B組，SOD活性低于B組。結(jié)果表明，在海水浸泡后，地塞米松在損傷早期確實(shí)能夠有效抑制火器傷導(dǎo)致的組織周圍炎癥反應(yīng)，減輕過氧化脂質(zhì)反應(yīng)，保護(hù)損傷的機(jī)體組織，這與多數(shù)研究的結(jié)論相一致[17-19]；但是在傷后中遠(yuǎn)期，影像學(xué)表現(xiàn)及骨缺損區(qū)域各時(shí)相點(diǎn)平均骨痂灰度值的比較證實(shí)，兩組動(dòng)物傷后4～12周的骨缺損愈合程度并無明顯差異。組織學(xué)上，術(shù)后4周、8周、12周時(shí)，兩組成骨質(zhì)量也無明顯差別；在8周和12周時(shí)，兩組標(biāo)本中MDA含量及SOD活力也無明顯差異。以上結(jié)果表明，在傷后中遠(yuǎn)期，地塞米松對于損傷組織的周圍炎癥抑制及緩解過氧化脂質(zhì)反應(yīng)作用并不明顯；而從骨缺損愈合的結(jié)果來看，地塞米松對于火器傷導(dǎo)致的骨缺損合并海水浸泡并無明顯促進(jìn)愈合的作用。