使用堿性蛋白酶去除犬骨骼標本軟組織技術

萬 玲 ， 吉尚雷 ， 李春華 ， 王 超 ， 高 鋒 ， 王雨田 ， 崔曉雯 ， 田長永

(遼寧農業職業技術學院 ， 遼寧 營口 115009)

制作犬骨骼標本不僅可以鍛煉學生的動手能力，開拓學生的創新思維，還可以將標本作為直觀教具，幫助學生理解犬骨骼的構造與組成，強化學生對犬解剖知識的理解，鞏固教學效果[1-3]。犬骨骼標本在實際教學過程中起到其他教具不可替代的作用，對獸醫診療人員的臨床工作也能起到較大的指導作用[4]。制作犬骨骼標本的步驟主要包括去除軟組織、脫脂、漂白以及模仿動物的正常自然姿態進行串接。軟組織的去除程度關乎于后續的脫脂時間、漂白效果及骨骼完整性，是制作優質犬骨骼標本的關鍵。有動物解剖學者使用濃度為0.3%～0.5%的蛋白酶去除倉鼠和家兔的肌肉組織來獲取骨骼標本[5-7]； 還有臨床解剖學者使用濃度為1.0%～1.5%的堿性蛋白酶去除人體骨骼標本軟組織[8]。然而蛋白酶是否適合犬骨骼標本的制備尚未見報道，為此，筆者在參考以上文獻的基礎上嘗試選用5種不同濃度的堿性蛋白酶對犬四肢骨、胸骨和肋骨、脊柱骨及頭骨4組標本進行軟組織去除試驗，觀察不同濃度堿性蛋白酶分解液在不同作用時間內，對不同部位骨骼的軟組織的分解效果，以期建立一種優于傳統方法的適合于制備犬骨骼標本的蛋白酶分解方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 堿性蛋白酶粉[食品級堿性蛋白酶(酶活性 200 000 U/g)]，購自夏盛實業集團有限公司；十二烷基苯磺酸鈉(LAS)，購自天津致遠化學試劑有限公司；30%過氧化氫(H2O2)；帶蓋有機玻璃容器；恒溫培養箱。

1.2 試驗動物 試驗犬(體重4～6 kg，年齡3～5歲)5只，均來自遼寧農業職業技術學院小動物飼養場。

1.3 方法

1.3.1 骨骼樣本預處理 將5只試驗犬安樂死后進行剝皮，稱量其剝皮后體重并記錄，剃除附著在骨骼上的大塊肌肉，每只犬均剃除約70%左右,分別稱量剔除大塊肌肉后骨骼樣本的重量(骨骼重量)。

1.3.2 配制不同濃度的堿性蛋白酶分解液 將堿性蛋白酶(g)與蒸餾水(mL)分別按不同濃度(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%)配制堿性蛋白酶分解液(pH 6.8～8.5)；每份骨骼使用堿性蛋白酶分解液的體積/mL=骨骼重量/g×5[6]。

1.3.3 恒溫培養 將1.3.2中配制好的5種不同濃度的堿性蛋白酶分解液放在5個有機玻璃容器(有蓋)內，再將1.3.1中預處理過的5只犬的骨骼樣本分別放入上述5個有機玻璃容器內(1只犬的骨骼樣本放在1個濃度的堿性蛋白酶分解液中)，放入恒溫培養箱調至約50 ℃(堿性蛋白酶水解的最適溫度)[8]。

1.3.4 堿性蛋白酶分解液分解效果觀察 分別于作用12、24、36 h和48 h查看不同濃度的堿性蛋白酶分解液對軟組織的分解速度和對骨骼的影響，并根據前期消化程度，在作用54、60 h和66 h再次觀察對不同部位骨骼的影響。

1.3.5 脫脂 將軟組織分解完的犬骨骼放入0.02% LAS溶液中室溫進行脫脂，隨著時間變化觀察骨骼顏色和溶液中的油脂量。

1.3.6 漂白 將脫脂后的犬骨骼放入配制好的4% H2O2中漂白，每隔1 h觀察漂白效果，漂白后的骨骼用清水沖洗2次，晾干即可。

2 結果

2.1 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用不同時間的軟組織分解效果 通過對預處理后的5只犬的頭骨、四肢骨、胸骨和肋骨及脊柱骨分別在5種濃度的堿性蛋白酶分解液中進行分解觀察，結果見表1～4，發現預處理過的5只犬的骨骼在除0.1%濃度外的其他4種濃度的堿性蛋白酶分解液中作用48 h后軟組織殘留量非常少，只有微量筋膜等結締組織殘留，軟組織基本分解且骨質均完好；而在0.1%濃度的堿性蛋白酶分解液中除頭骨作用60 h后有微量組織殘留之外，其他部位骨骼作用60 h后的軟組織沒有完全分解。

表1 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用不同時間對頭骨軟組織的分解效果Table 1 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on skull soft tissues decomposition after different times

表2 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用不同時間對四肢骨軟組織的分解效果Table 2 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on limbs soft tissues decomposition after different times

表3 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用不同時間對肋骨和胸骨軟組織的分解效果Table 3 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on ribs and sternums soft tissues decomposition after different times

表4 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用不同時間對脊柱軟組織的分解效果Table 4 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on spines soft tissues decomposition after different times

2.2 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用不同時間對骨骼的影響 于0.3%濃度的堿性蛋白酶分解液中，頭骨在作用48 h后，四肢骨在作用66 h后，胸骨和肋骨在作用60 h后所有軟組織完全分解(圖1)。在作用66 h后所有骨骼的骨質沒有明顯破壞，長骨的骨骺完好，顱骨的骨縫沒有明顯的分離現象，肋骨沒有斷裂。

圖1 0.3%堿性蛋白酶分解液去軟組織效果Fig.1 Effects of soft tissues removal in 0.3% alkaline protease solutionA:頭骨作用48 h； B:前肢骨作用66 h； C:肋骨作用60 hA: Skulls for 48 h; B: Front limb bones for 66 h; C: Ribs for 60 h

于0.5%濃度的堿性蛋白酶分解液中，脊柱在作用60 h后，胸骨、肋骨和頭骨在作用48 h后，所有軟組織完全分解；頭骨在作用54 h后出現表面骨質破壞；四肢骨在作用36 h后出現了骨骺斷裂現象，但還殘存微量結締組織，在作用60 h后殘存的微量結締組織完全分解、骨骺脫落(圖2)。

圖2 四肢骨骨骺脫落Fig.2 Epiphysis of limb bones fell off

于0.7%和0.9%濃度的堿性蛋白酶分解液中，脊柱在作用60 h后，胸骨、肋骨和頭骨在作用48 h后，所有軟組織完全分解；但頭骨在作用54 h后，出現表面骨質破壞，在作用60 h后有骨裂現象(圖3B)；而在0.3%濃度的堿性蛋白酶分解液中作用相同時間頭骨完好(圖3A)。

圖3 不同濃度堿性蛋白酶分解液作用的頭骨Fig.3 Skulls in different concentrations of alkaline protease solutionsA:0.3%濃度作用60 h； B:0.7%濃度作用60 h； 箭頭：明顯骨裂A:0.3% concentration for 60 h; B:0.7% concentration for 60 h; Arrow:Apparent fracture

于0.7%和0.9%濃度的堿性蛋白酶分解液中，四肢骨在作用36 h后出現了骨骺斷裂現象，但還殘存微量結締組織，在作用48 h后恥骨聯合處開裂(圖4)，在作用60 h后殘存的微量結締組織才完全分解。

圖4 恥骨聯合處開裂Fig.4 Pubic symphysis was dehissed 箭頭：殘余微量結締組織Arrow: A small amount of residual connective tissues

2.3 脫脂效果 利用除0.1%濃度以外的其他4種濃度的堿性蛋白酶分解液去除軟組織48 h后的骨骼油脂量均很少，在0.02% LAS溶液中室溫進行脫脂24 h后，溶液中油脂量較少。

2.4 漂白效果 經過0.3%濃度堿性蛋白酶分解液去軟組織和0.02% LAS溶液脫脂后的骨骼，在4%H2O2中漂白4 h后，骨骼潔白(圖1)。

3 討論

3.1 犬個體的差異對蛋白酶作用的影響 犬的體重和骨質的堅硬程度決定了骨骼標本的質量[4]。幼齡犬骨質未發育完全，老齡犬則骨質疏松，利用蛋白酶處理幼齡和老齡犬的軟組織都會對骨骼造成損傷，影響后續標本的質量。體重應選擇均等且偏瘦的犬，偏胖的犬軟組織較多，前期剃除附著的大塊肌肉較困難。因此應選擇3～5歲齡且體重均在4～6 kg的青壯年犬制作骨骼標本，此年齡段均等體型的犬骨質堅硬，較易剔除大塊肌肉，剩下的軟組織易被堿性蛋白酶分解液分解且誤差小。

3.2 剃肉程度對堿性蛋白酶分解時間的影響 本試驗發現，前期骨骼上的大塊肌肉剔除程度可影響堿性蛋白酶的處理時間，剃除過少剩余過多會延長分解時間，增加做標本的時間周期；剃除肌肉過多，剩的軟組織很少雖然分解時間短，但容易傷及骨骼，影響骨骼的完整性。本試驗過程中通過摸索發現，剃除剝皮后犬體重的70%左右為宜。

3.3 堿性蛋白酶分解液去除軟組織對后續脫脂和漂白的影響 本試驗證明，利用堿性蛋白酶分解液去除軟組織后的骨骼油脂量很少，大部分油脂在浸泡過程中溶解在堿性蛋白酶分解液中，大大加快了后續脫脂的過程。0.02%LAS溶液室溫脫脂12 h[4]后，骨骼上基本無油脂，溶液中油脂量較少，并且骨骼的顏色較白。一般情況下，骨骼油脂量越大，骨骼顏色越黑。

3.4 使用堿性蛋白酶分解液去除軟組織的優點 由于自來水的pH介于6.8～8.5，堿性蛋白酶在pH 6～10時比較穩定，為了節約成本，本試驗使用的是夏盛食品級工業堿性蛋白酶(活性200 000 U/g)，根據試驗結果估算，處理1副完整的犬骨骼大約需要15 g堿性蛋白酶，成本極其低廉。本方法設備簡單，靈活選擇，只要能提供酶消化所需溫度的裝置便可，如恒溫培養箱、恒溫水浴鍋都可以實現。此外，本方法安全省力，可操作性強。使用堿性蛋白酶分解液處理骨骼上的軟組織更加溫和，對骨骼損傷較小，通過浸泡就能夠實現軟組織的去除，尤其是一些死角也可以消化干凈[7]，堿性蛋白酶對人體的傷害非常小，可隨時取出觀察骨骼變化，減少因時間長未觀察引起的對骨骼的損傷，并且不會污染環境，廢液容易處理，可直接排入下水道。