一種新型次氯酸消毒劑的殺菌效力評價

張向陽 ， 張靖菊 ， 陳 晨 ， 劉春雙 ， 王玉鳳 ， 張志博 ， 朱石荻 ， 劉欣彤 ， 劉義明 ， 徐 飛 ， 陳孝杰 ， 李秀波

(中國農業科學院飼料研究所 ， 北京 海淀 100044)

合理使用消毒劑做好畜舍和生活環境的凈化消毒，對阻止疫病的傳播和擴散尤為重要[1]，做好畜禽圈舍及環境消毒是畜牧業健康發展的關鍵[2]。養殖場消毒中傳統的次氯酸鹽消毒劑對設備有腐蝕，且刺激性強，新型次氯酸消毒劑因濃度低、無殘留、低腐蝕性等優點越來越得到重視[3]，有報道表明，現場制備的弱酸性次氯酸水在養殖環境和圈舍消毒方面表現良好[4-5]。本試驗參照《獸用消毒劑鑒定技術規范》[6]和《消毒技術規范》[7]，設計了懸液定性、定量殺菌試驗和畜舍現場消毒試驗，對本實驗室研制的一種瓶裝次氯酸消毒劑的殺菌效力進行科學系統的評價，為其作為新獸藥的申報和獸醫臨床的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑 次氯酸消毒劑由中國農業科學院飼料研究所提供，批號：200820；選擇某獸用次氯酸鈉消毒劑，市面上購買，批號：20200501。現場試驗用畜舍4 m2/個，水泥地面；試驗用大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)8099和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)ATCC6538，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；乙型溶血性鏈球菌(Beta-hemolyticStreptococcus,S.hemolysis)32210和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)63501，均購自中國醫學微生物菌種保存管理中心；硫代硫酸鈉容量分析用溶液(0.101 0 mol/L，批號：5451)，購自北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司；可溶性淀粉、碘化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和吐溫-80(均為分析純)，均購自國藥集團化學試劑有限公司；藏紅T和孔雀石綠(生物染色劑)，均購自國藥集團化學試劑有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基(Trypytic soy agar，TSA)和LB培養基，均購自青島海博生物技術有限公司；小牛血清，購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.2 儀器 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺，購自蘇州安泰空氣技術有限公司；ME203E/02型電子天平，購自梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 有效氯含量測定 以有效氯含量作為評價含氯消毒劑濃度的指標，參照衛生部2018年發布的《含氯消毒劑衛生要求》[8]中的方法測定有效氯含量。

1.3.2 細菌懸液制備 取凍干菌種增菌，單菌落傳代，單菌落接種液體培養基，37 ℃培養18～24 h得到細菌懸液，稀釋成106～107CFU/mL菌懸液備用。

1.3.3 中和劑鑒定試驗 以大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌為指示菌。中和劑采用含硫代硫酸鈉、吐溫-80的LB肉湯，磷酸鹽緩沖液稀釋菌懸液，無菌硬水稀釋消毒劑。參照《獸用消毒劑鑒定技術規范》[6]設計6組試驗，試驗分組及評價標準見表1。

按照公式(1)計算誤差率。

PX/%=∑|X-Xi|÷∑Xi×100%

(1)

式中PX為組間菌落誤差率；X為3組、4組、5組間菌落平均值；Xi為各組菌落平均數。

表1 中和劑鑒定試驗分組及評價標準Table 1 Neutralizer identification test groups and evaluation criteria

1.3.4 懸液定性殺菌試驗 參照《獸用消毒劑鑒定技術規范》[6]，每種消毒劑按有效氯含量稀釋成125、100、75、50、25、12.5、6.25 mg/L和3.125 mg/L共8個濃度，選取1、5、10、15、30 min和60 min共6個時間點進行試驗。

1.3.5 懸液定量殺菌試驗 參照《獸用消毒劑鑒定技術規范》[6]和定性試驗結果初步確定消毒劑作用時間和濃度，參照公式(2)計算殺滅對數。平均殺滅對數≥3，殺毒效能有效[7]。

殺滅對數=原菌液平均活菌濃度的對數(N0)-消毒劑處理組活菌濃度的對數(Nx)

(2)

1.3.6 畜舍現場消毒試驗 次氯酸消毒劑設置高濃度(150 mg/L)、中濃度(75 mg/L)、低濃度(50 mg/L)，次氯酸鈉消毒劑按推薦劑量1∶100稀釋后有效氯含量為486 mg/L，用自來水代替消毒劑同步試驗，作為陰性對照，進行自然菌的現場消毒試驗、對特定菌的現場消毒試驗和畜舍空氣現場消毒試驗。試驗前對畜舍沖洗除污，自然干燥后備用。對特定菌的現場消毒試驗提前將制備菌液均勻涂于采樣部位，保證采樣部位含菌量為105～106CFU，自然晾干后進行試驗，對自然菌的現場消毒試驗和畜舍空氣現場消毒試驗無此操作。消毒時使用噴霧器噴灑整個畜舍，包括畜舍內空氣。采樣位置：每個濃度每次使用3個圈舍作為平行，試驗前在空圈舍地面、欄桿、食槽用記號筆分別標記出5 cm×5 cm區域的采樣部位，要求采樣部位相鄰而不相同，結果取平均值；采樣方法：無菌棉拭子浸潤中和劑后，在采樣區域橫豎各用力擦拭10次，并不斷轉換拭子擦拭面，將拭子棉花端剪入無菌離心管內，封好；采樣時間：消毒前、消毒后10、20、30 min和60 min。檢測方法：樣品用無菌磷酸鹽緩沖液充分洗脫后梯度稀釋，在LB瓊脂平皿或含5%小牛血清的TSA瓊脂平皿均勻涂布，活菌計數培養。在做表面消毒的同時進行空氣消毒試驗，采用自然沉降法，時間點同上。將含5%小牛血清的TSA平皿均勻放置在畜舍不同位置敞口5 min，實驗室培養計數。參照《消毒技術規范》[7]，現場消毒試驗對環境自然菌的殺滅對數≥1，對特定菌的殺滅對數≥3，可判為消毒合格。

2 結果

2.1 中和劑鑒定試驗 由表2可知，5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L吐溫-80+20 g/L肉湯作為中和劑，1組、2組、6組無菌生長，E.coli和B.subtilis分別作為指示菌的3組、4組、5組間菌落數誤差率分別為1.21%和13.50%，均低于15%，可判定該中和劑能有效中和消毒劑，且對E.coli和B.subtilis生長均無影響。

表2 中和劑鑒定試驗Table 2 Neutralizer identification test

2.2 懸液定性殺菌試驗 由表3、表4可知，室溫作用1 min，次氯酸消毒劑完全殺滅E.coli所需有效氯含量最低為25 mg/L，完全殺滅S.aureus和S.hemolysis的最低有效氯含量均為75 mg/L；次氯酸鈉消毒劑完全殺滅S.aureus的最低有效氯含量為25 mg/L，完全殺滅E.coli和S.hemolysis所需有效氯含量最低為50 mg/L；2種消毒劑對B.subtilis作用5 min，完全殺滅B.subtilis的最低有效氯含量分別為75 mg/L和125 mg/L。初步確定定量殺菌試驗消毒劑有效氯含量選擇6.25～125 mg/L。

表3 次氯酸消毒劑對細菌的定性殺菌效力Table 3 Qualitative bactericidal efficacy of hypochlorous acid disinfectant on bacteria

表4 次氯酸鈉消毒劑對細菌的定性殺菌效力Table 4 Qualitative bactericidal efficacy of sodium hypochlorite disinfectant on bacteria

2.3 懸液定量殺菌試驗 如圖1所示，當有效氯含量為3.125 mg/L時，對E.coli，次氯酸消毒劑作用2 min殺滅對數達3以上，而次氯酸鈉消毒劑則需5 min；對S.aureus，次氯酸消毒劑的最短有效殺滅時間為2 min，次氯酸鈉消毒劑則為30 min；對S.hemolysis，次氯酸消毒劑作用60 min殺滅對數達6以上，次氯酸鈉消毒劑無有效消毒效能；對B.subtilis，2種消毒劑最短有效殺滅時間均為10 min。

圖1 有效氯含量3.125 mg/L的2種消毒劑對細菌的定量殺菌效力Fig.1 Quantitative bactericidal efficacy of two disinfectants containing 3.125 mg/L of available chlorine on bacteria

2.4 畜含現場消毒試驗

2.4.1 對自然菌的現場消毒 由表5可知，次氯酸消毒劑有效氯含量為75 mg/L和150 mg/L時，消毒10 min，對畜舍不同位置自然菌的殺滅對數達1以上；次氯酸消毒劑有效氯含量為50 mg/L時，消毒10 min，對欄桿和食槽上自然菌的殺滅對數在1以上，對地面自然菌的殺滅對數低于1。次氯酸鈉消毒劑使用推薦濃度(486 mg/L)，在不同作用時間對欄桿、食槽和地面上自然菌的殺滅對數均在1以上。

表5 2種消毒劑作用不同時間對畜舍不同位置自然菌的消毒效果Table 5 Disinfection effect of two disinfectants on natural bacteria in different positions of livestock houses at different time

2.4.2 對特定菌的現場消毒 由表6可知，次氯酸消毒劑中濃度(75 mg/L)與次氯酸鈉消毒劑推薦濃度(486 mg/L)對不同位置特定菌作用10 min，殺滅對數均在3以上。

表6 次氯酸消毒劑中濃度(75 mg/L)和次氯酸鈉消毒劑推薦濃度(486 mg/L)對畜舍不同位置特定菌的消毒效果對比Table 6 Comparison of the disinfection effect of hypochlorous acid disinfectant medium concentration (75 mg/L) and sodium hypochlorite disinfectant recommended concentration (486 mg/L) on specific bacteria in different positions of livestock houses

2.4.3 畜舍空氣現場消毒 由圖2可知，次氯酸消毒劑中濃度(75 mg/L)和高濃度(150 mg/L)對空氣中自然菌的殺滅對數均在1以上，次氯酸消毒劑低濃度(50 mg/L)作用20 min消毒效果最好，殺滅對數在1以上，次氯酸鈉消毒劑推薦濃度(486 mg/L)殺菌對數不能穩定在1以上。

圖2 2種消毒劑對畜舍空氣中自然菌的消毒效果Fig.2 Disinfection effect of two disinfectants on natural bacteria in the air of livestock houses

3 討論

市面上常用的含氯消毒劑多以次氯酸鈉消毒劑為主，廣泛應用于家庭、食品、醫療、物流等多種領域[9]，但次氯酸鹽類消毒劑使用后會有鈉、鈣等金屬鹽離子殘留，可能會污染消毒物品表面。本試驗研究的次氯酸消毒劑見光易分解，使用無殘留，無需清洗[10]。本產品是本實驗室制備的次氯酸瓶裝溶液劑成品，殺菌效力穩定，適用于家庭等小規模、間斷性場景，使用方便，操作簡單，彌補了目前市面上使用次氯酸消毒劑時需借助次氯酸發生器現用現制[10-11]的短板。

對于本消毒劑多項殺菌力評價試驗顯示，與次氯酸鈉消毒劑相比，次氯酸消毒劑對多種自然菌和特定菌有效殺滅濃度更低，殺菌速度更快，且75 mg/L次氯酸消毒劑即可達到與486 mg/L次氯酸鈉消毒劑相同的消毒效果。

全國消毒產品網上備案信息服務平臺信息顯示[12]，2020年1月1日之后備案的次氯酸消毒劑數量激增，次氯酸消毒劑越來越受到人們的認可，相信未來該新型次氯酸消毒劑會在越來越多場景中使用。