3個(gè)粒重基因在青海高原春小麥品種中的分布

張業(yè)猛，朱麗麗，郭仁世，邢 瑜，馬德林，陳志國(guó)，劉德梅，王海慶

(1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039； 2.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所/中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810008； 3.青海省農(nóng)作物種子站，青海西寧 810003)

中國(guó)作為世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)大國(guó)，小麥產(chǎn)量直接影響糧食安全。因此，培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種是目前小麥育種的主要目標(biāo)之一。粒重作為小麥產(chǎn)量三要素之一，其性狀相對(duì)穩(wěn)定，主要受粒重基因加性效應(yīng)的影響。雖然近年來(lái)中國(guó)不同小麥生態(tài)區(qū)審定的品種粒重均有不同程度的提升，但關(guān)于小麥粒重基因標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和利用仍不夠廣泛和深入。青海是中國(guó)小麥高產(chǎn)區(qū)，高粒重是該地區(qū)小麥實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的重要因素之一。李紅琴等對(duì)青海省1957―2009年審定的春小麥品種的千粒重進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)66個(gè)品種的平均千粒重為45.91 g，20世紀(jì)90年代小麥品種的千粒重最大，為46.95 g，2000年以后略有下降，呈先升高后降低的趨勢(shì)，變異系數(shù)為12.57%。因此，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開(kāi)展青海省小麥的粒重育種很有必要。

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能夠加速育種進(jìn)程，提高選擇效率，已廣泛應(yīng)用于多種作物育種中，為優(yōu)良基因型的選擇和聚合雜交育種提供了技術(shù)支撐。Hanif等在小麥中克隆到基因，并開(kāi)發(fā)出功能標(biāo)記TaTGW6-A1-CAPS，用于檢測(cè)該基因的兩個(gè)等位變異和，并發(fā)現(xiàn)相較于，具有較高的粒重和產(chǎn)量。Ma等在小麥中克隆到基因，并開(kāi)發(fā)出功能標(biāo)記CW121和CW122，用于檢測(cè)(與高千粒重相關(guān))和(與低千粒重相關(guān))。Zhang等在小麥中克隆到基因，并開(kāi)發(fā)出功能標(biāo)記GS7D，用于檢測(cè)兩個(gè)等位變異和，并發(fā)現(xiàn)相較于/和/基因型，/基因型表現(xiàn)出較高的千粒重。Ma等在小麥中克隆到和，其中具有4種等位變異()，其中與高千粒重相關(guān)，且在中國(guó)小麥品種中分布頻率較高；而具有兩個(gè)等位變異()，其中與高千粒重、少分蘗數(shù)相關(guān)，并據(jù)此開(kāi)發(fā)了功能標(biāo)記，用于檢測(cè)這些等位變異。

競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)是利用通用熒光探針，針對(duì)廣泛的基因組DNA樣品，可以在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確判斷目標(biāo)SNPs和InDels，并進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因分型，是較為便捷的分子手段之一。為提高多個(gè)粒重基因的聚合效率和精準(zhǔn)度，了解現(xiàn)有原始材料的基因型很有必要。本研究利用Ramirez-gonzalez等公布的小麥KASP引物設(shè)計(jì)方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對(duì)青海高原地區(qū)49個(gè)小麥品種(地方品種、生產(chǎn)上發(fā)揮過(guò)作用的外引品種、通過(guò)審定品種和歷年主栽品種)的粒重基因變異類型進(jìn)行檢測(cè)，明確這些種質(zhì)資源中粒重基因的等位變異分布，以期為開(kāi)展分子設(shè)計(jì)和多基因聚合育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的49個(gè)小麥品種系本實(shí)驗(yàn)室自繁保留，審定信息來(lái)自《青海省農(nóng)作物品種志》和中國(guó)種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺(tái)(http://202.127.42.145/bigdataNew/home/ManageOrg)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 田間種植和千粒重測(cè)定

2013-2015年，所有材料種植在青海省海西蒙古族藏族自治州香日德鎮(zhèn)(36°3′52″ N， 97°47′45″ E，海拔 2 999 m)，每個(gè)品種種植5行，行長(zhǎng)2 m，行距0.2 m，每行播50粒種子。田間管理同大田生產(chǎn)，正常成熟后人工收獲，儲(chǔ)藏 備用。

每份材料取100粒種子，利用德國(guó)GTA公司的種子成像分析儀(Marvin-U)進(jìn)行粒徑測(cè)定，3次重復(fù)。利用德國(guó)Pfeuffer公司的數(shù)粒儀(Contador N02)進(jìn)行種子計(jì)數(shù)，每份材料取1 000粒種子，3次重復(fù)，然后采用便攜式電子天平(感量0.01 g)進(jìn)行千粒重測(cè)定。

表1 供試品種信息Table 1 Information of tested cultivars

1.3 DNA提取及KASP標(biāo)記檢測(cè)

每份材料選取大小均勻且籽粒飽滿的3粒種子，采用CTAB法提取樣本DNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。使用美國(guó)Thermo公司的微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop 2000C)進(jìn)行DNA濃度測(cè)定。

用于檢測(cè)3個(gè)粒重基因(、和)不同等位變異的KASP引物由北京佩萊技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。FAM-primer 5′末端連接1個(gè)FAM熒光基團(tuán)(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′)，HEX-primer 5′末端連接1個(gè)HEX熒光基團(tuán)(5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)。利用Bio-Rad CFX96 PCR 儀 (Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括4.78 μL DNA (5～50 ng·μL)，5 μL KASP 5000 V4.0 2×Master Mix，0.14 μL KASP Assay Mix(上下游引物混合液)，0.08 μL Mg。PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃復(fù)性1 min (每個(gè)循環(huán)下降0.6 ℃)，10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃復(fù)性1 min，30個(gè)循環(huán)；4 ℃避光保存，采用Axiom Analysis Suite 軟件進(jìn)行分型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)不同基因型小麥品種的千粒重表型進(jìn)行差異顯著性分析和方差分析(ANOVA)，并利用LSD法進(jìn)行多重比較。

表2 本研究所用的KASP引物Table 2 KASP primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 粒重相關(guān)性狀表型分析結(jié)果

2013-2015年，49個(gè)小麥品種的千粒重平均值分別為52.21、47.84和38.12 g，變化范圍分別為36.97～67.03、32.14～63.12和22.51～ 58.80 g，變異系數(shù)分別為13.55%、 13.06%和21.02%。49個(gè)小麥品種的粒長(zhǎng)平均值分別為 6.68、6.55和6.22 mm，變化范圍分別為5.57～ 7.60 mm、5.58～7.64 mm和5.77～6.89 mm，變異系數(shù)分別為7.38%、7.12%和 3.73%。49個(gè)小麥品種的粒寬平均值分別為 3.45、3.36和3.38 mm，變化范圍分別為2.97～3.77 mm、 2.89～3.66 mm和2.96～3.66 mm，變異系數(shù)分別為5.72%、5.54%和5.66%(表3)。進(jìn)一步對(duì)不同來(lái)源品種的粒重相關(guān)性狀進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)青海省育成品種的千粒重顯著高于引進(jìn)品種和地方品種，而青海省育成品種、引進(jìn)品種和地方品種之間的粒寬和粒長(zhǎng)無(wú)顯著差異(表4)。

2.2 粒重基因不同等位變異的分布及其對(duì)粒重的影響

從表5可以看出，供試小麥品種中，、和基因位點(diǎn)上均發(fā)現(xiàn)2種等位變異。位點(diǎn)上，和等位變異的分布頻率分別為69.39%和30.61%；位點(diǎn)上，和等位變異的分布頻率分別為46.94%和53.06%；位點(diǎn)上，和等位變異的分布頻率分別為97.96%和2.04%。3個(gè)基因位點(diǎn)的2種等位變異對(duì)粒寬和粒長(zhǎng)均無(wú)顯著影響，但對(duì)千粒重有顯著影響。 攜帶、和等位變異類型品種的千粒重分別顯著高于攜帶、和等位變異類型的品種，說(shuō)明、和為優(yōu)異等位變異。進(jìn)一步對(duì)不同來(lái)源品種中優(yōu)異等位變異的分布頻率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)和這兩種等位變異在青海省育成品種和引進(jìn)品種中的分布頻率明顯高于地方品種(表6)。

表3 不同年份間小麥粒重相關(guān)性狀表型分析Table 3 Phenotypic analysis of grain weight related traits of wheat in different years

表4 不同來(lái)源小麥品種粒重相關(guān)性狀的表型分析Table 4 Phenotypic analysis of grain weight related traits of wheat from different origins

表5 粒重基因的不同等位變異對(duì)小麥粒重相關(guān)性狀的影響Table 5 Effect of alleles of different grain weight genes on grain wheat related traits of wheat

表6 不同來(lái)源小麥品種優(yōu)勢(shì)等位變異的分布頻率Table 6 Distribution frequency of preponderant allelic variation of wheat from different origins

2.3 不同等位變異組合類型對(duì)小麥粒重的影響

從表7可以看出，供試小麥品種中，共發(fā)現(xiàn)5種等位變異組合類型，分布頻率為2.04%～ 36.73%。綜合2013-2015年的粒重相關(guān)表型數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)5種等位變異組合類型與千粒重顯著相關(guān)，而與粒寬和粒長(zhǎng)相關(guān)性不顯著。組合類型為//(含有3種優(yōu)異等位變異)的品種，千粒重顯著高于其他組合類型的品種；組合類型為//和//(含有2種優(yōu)異等位變異)的品種，之間千粒重?zé)o顯著性差異，但顯著高于組合類型為//(只含有1種優(yōu)異等位變異)的品種。此外，//組合類型品種的千粒重低于//組合類型的品種，原因可能是//組合類型的品種只有1個(gè)，結(jié)果不具有代表性，也可能是其他因素影響，但還需進(jìn)一步研究。總之，//等位變異組合類型為最優(yōu) 組合。

表7 不同等位變異組合對(duì)小麥粒重相關(guān)性狀的影響Table 7 Effect of allelic variation combination on grain wheat related traits in wheat cultivars

3 討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)一直是小麥育種的最主要目標(biāo)之一。隨著分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因編輯、染色體工程等現(xiàn)代育種技術(shù)的廣泛應(yīng)用，小麥粒重基因也得到了深入的研究，不斷有新的粒重基因被克隆和定位，并創(chuàng)造出了較為優(yōu)良的品種。目前，已克隆出、、、、、、等小麥粒重基因，并開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的功能標(biāo)記，可快速準(zhǔn)確鑒定不同小麥品種中控制粒重的相關(guān)基因及其等位變異類型的分布情況。劉永偉等利用基因的功能標(biāo)記CWI21和CWI22對(duì)539份黃淮麥區(qū)小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)等位變異的分布頻率明顯高于，且基因型材料的千粒重顯著高于基因型，進(jìn)一步證實(shí)為優(yōu)異等位變異。簡(jiǎn)大為等利用52個(gè)功能標(biāo)記對(duì)136份新疆小麥品種(系)的主要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)7個(gè)粒重基因的優(yōu)異等位變異在改良品種中的分布頻率明顯高于地方品種，并且大部分優(yōu)異等位變異的分布頻率隨著育種時(shí)期的推進(jìn)呈上升趨勢(shì)。

粒重和其他產(chǎn)量性狀都是由多基因控制的綜合性狀，只從單基因入手進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種達(dá)不到全面提升小麥產(chǎn)量的目的，必須實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)基因的聚合，才能實(shí)現(xiàn)培育高產(chǎn)小麥的目的。仝靖洋等對(duì)粒重相關(guān)基因的不同等位變異組合進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)///為最優(yōu)組合，其粒長(zhǎng)和千粒重較其他變異組合均顯著提高。張福彥等結(jié)合2個(gè)年度的千粒重表型，對(duì)、和基因的不同等位變異組合進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)攜帶等位變異組合//的小麥品種千粒重最高，是優(yōu)勢(shì)基因型組合。趙俊杰發(fā)現(xiàn)，粒重基因的優(yōu)異等位變異聚合可以提高品種的千粒重，但是對(duì)品種的穗粒數(shù)和有效分蘗無(wú)明顯影響。

本研究利用KASP標(biāo)記檢測(cè)3個(gè)粒重基因、和在49個(gè)青海主栽小麥品種中的分布，結(jié)果表明，3個(gè)粒重基因在供試材料中均有分布，有5種等位變異組合類型，其中，攜帶3個(gè)優(yōu)異等位變異組合 (//)材料的千粒重最高，為最優(yōu)組合。在供試材料中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)攜帶//、//和//組合的品種，并且同時(shí)攜帶3種劣勢(shì)等位變異組合小麥品種的千粒重均值也不是最低，原因可能是其他變異組合類型品種較少，不具有代表性；也有可能是青海高原小麥生長(zhǎng)后期，氣溫逐步下降，小麥籽粒整體灌漿期長(zhǎng)，最終導(dǎo)致粒重較高；此外，粒重受多基因控制，其他粒重基因?qū)π←溋Ｖ匾簿哂幸欢ǖ难a(bǔ)償，也是造成這一現(xiàn)象的原因，但具體原因還需要進(jìn)一步深入研究。陳麗華等對(duì)青海省推廣種植的61個(gè)春小麥主栽品種的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些品種的千粒重平均值為37.9 g，主成分分析顯示的4個(gè)主成分(產(chǎn)量因子、穗密度因子、粒數(shù)因子、粒重因子)的累積貢獻(xiàn)率達(dá) 89.37%，粒重因子在青海高原春小麥產(chǎn)量貢獻(xiàn)中占比較高，因此，開(kāi)展粒重基因相關(guān)研究非常 必要。