唾液：應用于運動訓練領域的潛力生物樣本

許毅梟，趙永才，高炳宏

（1. 上海體育學院 運動健康學院，上海 200438；2. 天津體育學院 社會體育與健康科學學院，天津 301617；3. 上海體育學院 競技運動學院，上海 200438）

監控運動員對運動訓練反應的常用指標來自血液和尿液樣本。一些無創生理指標（如心率變異性、體成分、微循環等）也常被用于訓練監控。唾液樣本是無創、容易快速采集的生物樣本，在運動訓練領域具有較大發展潛力[1]。已有國內外文獻報道了唾液在運動訓練監控中的應用情況，但其仍未成為運動訓練監控中的常用生物樣本。目前，唾液樣本中哪些生物標志物能夠應用于運動訓練監控，唾液生物標志物是否能及時、準確地反映運動訓練對機體的影響，不同運動訓練與唾液生物標志物的關系如何等尚不清楚，這限制了唾液樣本在運動訓練領域的應用。本文從唾液成分、唾液采集和檢測方法、運動訓練對唾液生物標志物的影響3個方面分析限制唾液生物標志物在運動訓練中研究和應用的主要原因，以期為唾液在運動訓練中的進一步研究和應用提供參考，幫助運動員、教練員、科研人員等更好地利用唾液樣本開展訓練監控等工作。

1 唾液成分

唾液是一種無色液體，密度在1.002～1.012 g/L，pH約為6.64[2]。唾液主要由低相對分子質量有機物質、激素和無機物組成。唾液中豐富的有機化合物主要由蛋白質、脂質等組成。唾液中的激素種類繁多，血液中的大多數激素能在唾液中進行測定，包括皮質醇、睪酮、脫氫表雄酮、雌激素以及醛固酮等。唾液中的無機化合物主要由離子組成，包括 Na+、K+、Ca2+、Cl-和HCO3-等。表1列出了唾液中常用于檢測的部分有機化合物、激素和離子。多數物質在唾液中的含量是血液中的1/10～1/1 000，如唾液總蛋白質含量是血液中的約1/1 000，唾液睪酮含量是血液中的約1/100，唾液中Na+含量是血液中的約1/10。也有少數物質在唾液中和血液中的含量相似或高于血液中的含量，如唾液葡萄糖、皮質醇和血液中的含量相似，α-淀粉酶和K+含量在唾液中高于血液中。盡管大多數物質在唾液中的含量低于血液中，但近年來研究[3]發現，唾液中部分生物標志物及血液中相應生物標志物與運動訓練的變化高度相關。

表 1 唾液和血液中部分物質正常范圍含量比較[3-5]Table 1 A comparison of the normal range of the content between saliva and blood

唾液中多數成分由唾液腺分泌，健康成年人唾液腺每天分泌750～1 500 mL唾液，其次是由血液中的物質轉移至口腔[6]。唾液腺分泌受自主神經的副交感神經和交感神經支配，副交感神經誘導的唾液腺分泌特征是唾液呈水樣流動，引起唾液中有機化合物和無機化合物含量降低[2]；交感神經誘導的唾液腺分泌特征是唾液輸出量較少，導致唾液中總蛋白質含量、離子含量等提升。安靜狀態下唾液腺以0.30～0.65 mL/min的速度分泌唾液到口腔中，而咀嚼或品嘗含檸檬酸食物可以將唾液分泌速度增加到1.5～6.0 mL/min[7]。研究[2]報道，在超過乳酸閾值或大于60%最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）的長時間運動中，唾液流速顯著降低，表明唾液流速可反映運動強度。

2 唾液采集和檢測方法

唾液成分受眾多因素影響，運動訓練、晝夜節律、年齡、性別、體質量和進食等均會影響唾液的分泌量和成分[4]。標準化唾液采集和檢測流程是獲得可靠數據的前提。

2.1 唾液采集方法

目前唾液采集方法并未標準化，不同采集方法對結果的影響較大，各類方法的優缺點如表2 所示。研究常用的唾液采集方法是全唾液采樣法，通過無刺激被動流口水或小刺激吐口水方式直接將唾液采集在小瓶中。拭子采樣、唾液腺采樣器采樣和微萃取采樣的采樣量較少，但會對唾液腺造成額外刺激[8]。

表 2 唾液采集方法的優缺點比較[9-10]Table 2 Advantages and drawbacks of saliva collected methods

唾液生物標志物含量也受晝夜變化影響，如安靜狀態下唾液睪酮水平存在晝夜節律，8:00最高、20:00最低[11]，因此唾液采樣應在每天同一時間段采集，以控制晝夜節律的變化。此外，運動后唾液生物標志物峰值出現的時間點也為唾液樣本采集時間提供了依據，如唾液皮質醇的峰值約在運動后30 min出現[12]，提示可在運動后20 min左右進行采樣以檢測唾液皮質醇含量。

2.2 唾液檢測方法

根據檢測原理唾液檢測方法主要分為免疫測試方法、分離方法和電化學方法。酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是檢測運動員唾液樣本較常用的免疫測試方法。分離方法主要包括液相色譜-串聯質譜（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）和氣相色譜-質譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）等色譜、質譜聯合分析方法。電化學方法包括安培法、伏安法和電化學阻抗譜等。不同唾液檢測方法的優缺點如表3所示。

表 3 唾液檢測方法的優缺點比較[5, 13-14]Table 3 Advantages and drawbacks of saliva detection methods

因易于操作且相對便宜，多數研究采用ELISA檢測唾液樣本中的類固醇激素和蛋白質。但ELISA基于抗體和特定分析物之間的化學結合反應進行分析，若抗體與結構相似化合物產生交叉反應則可能影響測試的準確性，如文獻[15]報道，唾液中的皮質醇和可的松分子結構相似，這會干擾皮質醇的ELISA檢測結果。此外，由于不同ELISA的設計可能不同，抗體分析物的相互作用也可能發生變化，影響ELISA檢測結果。盡管已經開發了一些轉換表用于比較常見的不同ELISA檢測結果[16]，但Büttler等[17]將不同ELISA試劑盒轉換后的結果和同位素稀釋LC-MS測試結果進行比較，發現ELISA試劑盒轉換后的結果并不精確。因此，ELISA并不適用于多數唾液生物標志物的檢測，未來研究應嘗試采用靈敏度和準確度較高的檢測方法進行唾液分析。

近年來研究提出結合使用液相色譜（Liquid Chromatography，LC）或氣相色譜（Gas Chromatography，GC）與質譜（Mass Spectrometry，MS）分析唾液生物標志物，可以提高選擇性、靈敏性和準確性。GC-MS 因其極高的色譜分離能力和額外的質量選擇分離能力在類固醇分析中具備良好的潛力[18]。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）通常與串聯質譜聯用，可以降低樣本檢測量。高效液 相 色 譜-串 聯 質 譜 分 析（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）具備快速、可靠、高精確度的優勢[19]。但目前僅有少數研究采用分離方法檢測唾液樣本，未來研究可以多嘗試采用分離方法開展唾液樣本研究，加快建立唾液樣本評價體系。

在唾液檢測中免疫測試方法和電化學方法可以結合使用[20]。電化學方法簡便、溶劑消耗少，最常見的是伏安法、安培法和電位法等，具有小型化和便攜的優勢，為即時測量唾液生物標志物提供了可能[21]。此外，英國體育學院（English Institute of Sport，EIS）于2020年8月發布的唾液檢測新技術Hormonix引起了廣泛關注[22]。該技術具備快速、準確等優勢，但測定的唾液生物標志物、檢測方法和分析應用情況等尚不清楚，目前僅小范圍地應用于英國優秀運動員。

3 運動訓練對唾液生物標志物的影響

唾液采集具備無創、容易采集和感染風險低等優勢[4]，其生物標志物可以較及時地反映運動訓練對運動員的影響，避免過度訓練，預防運動損傷和疾病，還可以縮短訓練監控的周期，以便更精確地掌握運動員生理狀態周期性變化規律。唾液生物標志物可評估訓練強度和訓練量，以及監控身體壓力反應、肌肉損傷程度、免疫和炎癥反應、氧化狀態等（圖1）[14]，此外，唾液容易采集和無創的特點便于興奮劑篩查，但目前世界反興奮劑機構官網上沒有使用唾液樣本進行興奮劑檢測的程序。近年來不同運動訓練對唾液生物標志物影響的研究如表4所示。

圖 1 唾液生物標志物在運動訓練領域的應用Figure 1 The applications of saliva biomarkers in sport sciences

近年來研究[23]證明，唾液和血液中部分生物標志物與運動訓練的反應有較強相關性，唾液樣本能夠用于運動訓練監控[23]。Ngamchuea等[3]的研究報道了唾液中睪酮（r＞0.7）、皮質醇（r＞0.8）、醛固酮和胰島素含量與血液中含量高度相關。類似研究[2]也表明，安靜狀態下唾液中睪酮（r=0.7～0.97）、皮質醇（r=0.89）與血液中含量高度相關，運動中和運動后的唾液皮質醇和血液皮質醇含量高度相關。可見，靜息狀態下唾液睪酮和皮質醇能代替血液反映機體的合成代謝狀態，用于監控運動員的機能狀態。近期還有研究[24-25]報道，唾液脫氫表雄酮、孕酮、α-淀粉酶、免疫球蛋白A、谷胱甘肽、尿酸等多種物質也與血液中含量有較強相關性。這些研究表明，唾液與血液中部分激素類物質和有機化合物含量有較強相關性，為唾液樣本應用于運動訓練提供了有利證據。

表 4 運動訓練對唾液生物標志物的影響Table 4 Effects of exercise and training on saliva biomarkers

3.1 運動訓練對唾液壓力生物標志物的影響

訓練和比賽會影響運動員的心理和生理壓力反應[26]。心理壓力是情緒的緊張水平[27]。生理壓力來源于自主神經系統的激活以及下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活[28]，唾液睪酮、皮質醇和α-淀粉酶是反映運動員生理壓力的常用唾液生物標志物。睪酮是雄激素的一種，屬于類固醇激素，能促進合成代謝，可反映運動訓練對機體合成代謝的影響。皮質醇是腎上腺皮質分泌的一種糖皮質激素，能促進分解代謝，可反映運動訓練對機體分解代謝的影響。睪酮與皮質醇的比值能反映運動訓練對機體整體恢復情況的影響[29]。不同強度、持續時間的運動訓練和唾液采樣時間點會影響唾液睪酮、皮質醇和α-淀粉酶的檢測結果。唾液睪酮、皮質醇適用于評估高強度訓練后運動員生理壓力的變化，而唾液α-淀粉酶更適合評估有氧運動后運動員生理壓力的變化。

短時間高強度運動后唾液皮質醇明顯增加，運動強度越大，運動后唾液皮質醇含量越高。長時間高強度運動后唾液皮質醇增加，睪酮下降。Monje等[30]的研究報道了20名優秀長跑運動員單次高強度間歇訓練后（以90% V ˙O2peak的強度完成10個4 min間歇跑）唾液皮質醇增加，睪酮水平保持穩定。Crewther等[31]研究發現，9名健康男性完成30 s Wingate 自行車測試后唾液睪酮和皮質醇顯著升高，唾液皮質醇在運動后20 min達到峰值，唾液睪酮在運動后10 min達到峰值。此外，Leicht等[32]研究發現，運動強度越大，運動后唾液皮質醇含量越高。Pe?ailillo等[33]研究發現，足球比賽后9名足球運動員唾液皮質醇無明顯變化，唾液睪酮含量下降30.6%，睪酮與皮質醇的比值下降64.2%。足球比賽時長通常為90 min，且運動強度較大，提示長時間高強度運動能降低唾液睪酮含量和睪酮與皮質醇的比值。

一些研究報道了高強度運動項目備賽期間唾液睪酮和皮質醇的變化。Pritchard等[28]在賽季備賽前、比賽開始前、比賽結束后分別對46名足球運動員采集唾液樣本，發現運動員不同賽季階段的訓練安排、生活節律是影響唾液免疫球蛋白和皮質醇含量的主要因素。Guilhem等[34]在24名高水平田徑運動員為期20周的備賽過程中，每周一同一時間點采集唾液樣本，檢測壓力生物標志物如皮質醇、睪酮、α-淀粉酶和嗜鉻粒蛋白A，發現唾液壓力生物標志物對備賽期間的訓練內容敏感。這些研究表明，已有運動隊將唾液作為日常訓練監控和長期跟蹤測試的樣本，這能為其日常的訓練和備賽提供有用信息。

Thorpe等[35]發現，足球比賽后即刻唾液睪酮、皮質醇未顯著變化。Crewther等[36]發現，71名舉重運動員在模擬奧運會舉重比賽后即刻的唾液皮質醇和睪酮未出現顯著變化，而血液中皮質醇和睪酮有顯著變化。這2項研究與類似研究結果不同，其原因可以通過激素動力學解釋。唾液睪酮和皮質醇主要由血液轉運至唾液，激素從血液轉運至唾液需要一定時間。Thorpe等[35]和Crewther等[36]均是在比賽后即刻進行唾液采樣，而Monje等[30]在運動后20 min進行唾液采樣，Crewther等[31]更是在30 s Wingate自行車測試后多個時間點進行采樣。由于睪酮和皮質醇從血液轉運至唾液需要一定時間，唾液采樣時間點會影響短時間高強度訓練后唾液睪酮和皮質醇含量檢測的結果，因此建議短時間高強度訓練后間歇約20 min再進行唾液采樣。此外，唾液脫氫表雄酮評價女性合成代謝水平比唾液睪酮更精確。Granger等[41]發現，血清與唾液中脫氫表雄酮水平之間存在很強的線性關系。由于女性唾液睪酮含量非常低， Filaire等[42]提議使用唾液脫氫表雄酮代替唾液睪酮，評估女性運動員的合成代謝水平。

有氧運動后唾液α-淀粉酶明顯增加。作為交感神經活性增加的標志物，唾液α-淀粉酶可用作運動員壓力反應的唾液生物標志物[43]。Ali等[44]發現，有氧運動后唾液α-淀粉酶含量明顯增加。Capranica等[45]發現，長時間有氧訓練結束后唾液α-淀粉酶的變化比唾液皮質醇更明顯。類似研究[27]也得出同樣的結果。唾液α-淀粉酶對有氧運動更敏感，可能是因為其由自主神經系統控制的唾液腺產生，而皮質醇等激素是從血液轉運到唾液的。唾液α-淀粉酶是有氧運動后評估運動員生理壓力變化的主要唾液生物標志物。

3.2 運動訓練對唾液免疫標志物反應的影響

唾液中含有較多免疫標志物，唾液免疫球蛋白A（Salivary Immunoglobulins A，SIgA）是唾液分泌物中含量較多的免疫球蛋白，SIgA阻止病毒病原體通過黏膜進入人體，是上呼吸道的第一道防線和黏膜免疫的最佳指標[46]。監控SIgA水平能夠預防上呼吸道感染，降低感冒發生的風險，并為訓練負荷的管理提供參考。口腔黏膜中的其他免疫球蛋白包括唾液免疫球蛋白M（Salivary Immunoglobulin M，SIgM）和唾液免疫球蛋白G（Salivary Immunoglobulin G，SIgG）。與SIgA相比，報道運動訓練對SIgM 和 SIgG影響的研究較少。

運動強度影響SIgA含量，高強度運動后SIgA明顯下降。在日常足球訓練課[35]、網球訓練課[47]或一般力量訓練[48]后，SIgA沒有顯著變化；而在70%VO2max下長時間騎自行車[49]、50 km越野滑雪比賽[50]和三項全能比賽[51]后，SIgA顯著下降，表明長時間高強度運動后SIgA顯著下降，而中低強度運動訓練對SIgA影響較小。此外，急性高強度運動后，SIgA顯著下降，但在運動后24 h內恢復正常水平[52]。SIgA含量也受到唾液流速的影響，唾液流速越大，稀釋作用越明顯；反之，唾液流速降低導致SIgA含量明顯增加[2]，在分析SIgA時應控制好每次采集唾液的流速以控制變量。SIgA對運動強度較為敏感，急性高強度訓練和長時間高強度訓練后運動員的SIgA含量明顯下降，而長時間中低強度訓練后SIgA含量的變化較小。研究[6]發現，短時間高強度運動后運動員SIgG和SIgM水平沒有明顯變化，而 SIgA 水平下降，表明SIgG和SIgM對短時間高強度運動的敏感程度不如SIgA。2 h自行車騎行訓練或曲棍球比賽后SIgG和SIgM 含量明顯下降[2]，提示SIgM和SIgG可用于評估長時間訓練后機體的免疫變化。

3.3 運動訓練對唾液肌肉損傷生物標志物的影響

運動導致肌肉損傷的主要機制包括肌纖維損傷、鈣穩態變化和炎癥過程，肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）、乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）和天冬氨酸轉氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）是肌肉組織損傷的生物標志物[53]。肌肉損傷后CK、LDH和AST會從肌細胞中泄露至血液。這3種酶能在血液和唾液樣本中進行測定[37]。CK是肌肉損傷的重要特異性標志物，但唾液CK的含量較低，可能是由于CK從血液傳遞到唾液限制了唾液中CK的含量[54]。Barranco等[37]報道了1場5人制足球比賽后11名足球運動員唾液和血液中CK的變化，發現賽后12 h唾液和血液CK達到峰值，唾液CK含量為50.9 U/L，血液CK含量為290 U/L，前者約為后者的1/6。González Fernández等[38]報道了3場7人制橄欖球比賽后27名運動員CK、LDH和AST含量的變化，發現比賽后三者在唾液中的含量發生不同程度的變化，其中AST變化最顯著，在橄欖球比賽后男性和女性的AST含量都明顯增加，且男性AST比女性增加幅度更大。此外，唾液AST含量與血液中相似，長時間高強度運動后的變化幅度甚至高于血液[37-38]。

唾液AST、CK和LDH能夠用于評估長時間高強度運動后運動員的肌肉損傷程度，唾液AST是更為敏感的唾液肌肉損傷標志物。盡管如此，不同運動強度和類型對唾液肌肉損傷生物標志物影響的研究仍相對匱乏，需要更多研究探討唾液中CK、LDH和AST能否用于評估不同運動后的肌肉損傷情況。

3.4 運動訓練對唾液氧化狀態標志物的影響

細胞代謝過程中會不斷產生自由基，氧化應激是氧化還原能力和自由基產生之間的不平衡導致的生理反應[55]。Biagini等[39]對10名游泳運動員進行自行車遞增負荷最大攝氧量測試，分析其對唾液樣本中氧化應激標志物的影響。該研究采用超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定丙酮、2-丁酮、2-戊酮、丙醛、丁醛、己醛、丙烯醛等唾液氧化應激標志物，發現遞增負荷運動期間唾液氧化應激副產物明顯增加，運動后恢復階段唾液氧化應激標志物急劇減少。氧化還原物質根據物質成分分為兩類：一類是超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽預氧化酶等酶類物質；另一類是膽紅素、尿酸、氧化還原谷胱甘肽、硫醇、白蛋白等非酶類物質[56]。Rodrigues De Araujo等[40]對32名足球運動員進行高強度間歇訓練（7次40 m短跑變向沖刺，每次間歇25 s），分析其對唾液氧化還原生物標志物的影響。該研究采用分光光度法和ELISA分析總膽汁酸、丙二醛、谷胱甘肽、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和尿酸的變化，發現高強度間歇訓練后僅有唾液尿酸水平顯著下降，而其他標志物變化并不明顯，表明短時間高強度間歇訓練可短暫抑制氧化還原能力，唾液尿酸水平是對短時間高強度間歇訓練更敏感的唾液氧化狀態生物標志物。另一項研究[57]也發現，在后檢測唾液中，尿酸是唯一變化顯著的唾液氧化還原生物標志物，唾液尿酸約占唾液總氧化還原能力的60%～70%。因此，唾液尿酸是唾液樣本中評估氧化還原能力的重要生物標志物之一[58]。

目前，不同運動強度和持續時間對唾液氧化狀態影響的研究相對匱乏，唾液氧化應激標志物對不同運動訓練的敏感程度還有待進一步證實，且運動員唾液中氧化狀態生物標志物的正常閾值尚不清楚，還需大量研究建立唾液氧化狀態生物標志物的評價體系，從而進一步探究不同運動訓練對各項目運動員氧化狀態的影響，獲取更多運動員對運動訓練適應情況的信息。

3.5 唾液樣本用于興奮劑篩查

興奮劑檢測主要使用尿液和血液樣本，世界反興奮劑機構制定了標準的血液和尿液樣本采集、轉移和檢測程序，而唾液樣本未被納入興奮劑檢測的可用樣本[59]。其首要原因是目標分析物在唾液中的含量較低，限制了唾液樣本在興奮劑檢測中的應用。例如，內源性同化雄激素（endogenous anabolic androgenic steroids，AAS）在唾液中的含量單位為pg/mL，而在尿液中的含量單位為ng/mL，唾液中AAS的含量是尿液中的約1/1 000，對儀器的精確度和檢測技術的要求非常高[60]。但隨著分析檢測儀器的發展，質譜色譜分析方法檢測底物含量的極限已達到pg/mL單位，能夠檢測到唾液樣本中興奮劑的含量，未來可采用質譜和色譜分析儀檢測唾液生物標志物的含量，為運動員唾液生物標志物含量的正常參考閾值提供數據支撐。

近年來研究表明，唾液樣本能夠應用于運動訓練領域，可能也能應用于興奮劑檢測領域。但由于研究較為匱乏，多數唾液生物標志物含量的正常閾值還有待闡明。未來需要進一步探究運動訓練與唾液生物標志物的關系，建立運動員唾液生物標志物的評價體系。

4 結論與展望

唾液樣本含有豐富的生物標志物，無創的優勢使其在運動訓練中有廣闊的應用前景。大多數物質在唾液中的含量是血液中的1/10～1/1 000，較低的底物含量對唾液檢測方法的精確度要求較高。全唾液被動流口水是常用的唾液樣本采樣方法，唾液樣本采樣時間點和測試分析方法尚未標準化。唾液睪酮、皮質醇、α-淀粉酶、免疫球蛋白A、天冬氨酸轉氨酶、谷胱甘肽、尿酸等多種唾液生物標志物含量與血液相應生物標志物含量有較高的相關性，為唾液壓力、免疫、肌肉損傷和氧化狀態生物標志物在運動訓練中的應用提供了有力證據。短時間高強度運動后唾液皮質醇明顯增加，運動強度越大，運動后唾液皮質醇含量越高。激素從血液轉運至唾液需要一定時間，建議短時間高強度訓練后間歇10～20 min進行唾液采樣以檢測唾液睪酮和皮質醇含量。長時間高強度運動后唾液皮質醇增加，睪酮下降。唾液α-淀粉酶對有氧運動更敏感，有氧運動后唾液α-淀粉酶明顯增加。未來仍需大量研究探討不同運動訓練與唾液壓力、免疫、肌肉損傷、氧化狀態生物標志物的關系，建立唾液樣本監控運動訓練的采集、檢測、分析和評價體系。

作者貢獻聲明：

許毅梟：設計論文框架，搜集、整理文獻資料，撰寫、修改論文；

趙永才：梳理論文，提出修改意見，指導修改論文；

高炳宏：提出論文選題，審核、指導修改論文。