基于電熱型掃描微鏡的微型雙光子顯微鏡探頭設計

余小敏 張林嘉 羅文松 謝會開

1(成都信息工程大學電子工程學院物理場生物效應及儀器四川省高校重點實驗室，成都 610225)2(北京理工大學信息與電子學院，北京 100081)

引言

雙光子熒光顯微成像技術最早在90年代初由美國康奈爾大學Denk 等實現[1]。 該技術利用雙光子激發熒光進行三維顯微成像，被認為是目前最適宜于活體光學顯微成像的技術之一[2]，也成為在體無創腦光學成像的首選技術[3]。 但經典的雙光子熒光顯微鏡體積大、重量重，無法微型化進行動物的在體試驗，也限制其便攜化用于運動狀態下活體動物的研究。 因此，將探測部分微型化，形成微型雙光子熒光顯微鏡探頭已成為可行的解決方案。體積小、重量輕的微型探頭可固定在小鼠頭部，因此不會對小鼠日常生活造成影響，有助于在體試驗。

為了實現探頭微型化，可使用光纖導入激光，通過掃描系統和光學系統，聚焦激光至樣品激發熒光，再采集熒光信號成像。 其中掃描系統設計是探頭微型化的關鍵，很大程度上決定了顯微鏡探頭尺寸和熒光成像質量。 目前有研究報道采用光纖端面振動掃描技術[4]，但是光纖端面掃描采樣率低，且光纖振動容易引起運動偽影，熒光成像質量不理想。 另外就是采用微機電系統 ( micro electromechanical system，MEMS)精密加工技術，目前基于MEMS 的掃描微鏡分為以下4 種技術。 1)靜電微鏡技術[5]采用鏡面和電極之間的靜電力使鏡面產生旋轉運動實現掃描，優點是速度快、功耗低，缺點是驅動電壓大，難以實現大掃描角。 2)電磁技術[6]利用線圈中電流在磁場作用下產生洛倫茲力，驅使微鏡運動，可以在低驅動電壓下獲得大掃描角和縱向位移，缺點是功耗大，磁鐵或線圈的尺寸限制其小型化。 3)薄膜壓電驅動掃描技術[7]，其驅動電壓、功耗低，但是材料的磁滯特性、電荷泄露，以及材料成分成為其發展的挑戰。 4)電熱型微鏡技術[8]，其利用支撐微鏡的執行器中不同材料的熱膨脹系數差異，實現微鏡運動。 該技術缺點是功耗高，材料熱響應慢，優點是驅動電壓低，掃描范圍大。 相比靜電驅動技術，制造過程簡單，成本低；比電磁驅動技術更易組裝和小型化，也沒有壓電材料的滯后性和安全風險，非常適合體內檢測或可穿戴式生物醫學成像。

本研究分析電熱型微鏡的結構與受力，制作了電熱型微鏡并測試其性能；在此基礎上，研制了微型雙光子顯微鏡探頭，并利用搭建的雙光子顯微熒光成像系統測試了顯微鏡探頭的熒光圖像分辨率，驗證了基于電熱型微鏡的雙光子熒光顯微鏡探頭用于腦部神經活動研究的可行性。

1 材料與方法

雙光子熒光顯微鏡探頭結構如圖1 中虛線部分所示，是由激發光系統和熒光采集系統組成。 激發光系統包括單模光纖、微鏡、匯聚透鏡、二向色鏡和GRIN 透鏡，熒光采集系統有聚合物光纖、耦合透鏡，復用的二向色鏡和GRIN 透鏡。

圖1 雙光子顯微鏡探頭系統框圖Fig.1 System diagram of two photon microscopy probe

1.1 電熱型微鏡受力分析

電熱型微鏡的執行器為雙層材料結構[9]，如圖2(a)所示，由Al 和SiO2組成。 雙層材料在應力失配條件下產生變形，應力失配包括在薄膜沉積或生長過程中產生的內部應力和在薄膜沉積或生長后產生的外部應力。 內應力可由腔室壓力和氣流波動、晶粒聚結、雜質摻入等多種因素引起，而外應力主要由外力、溫度變化等引起。

雙層材料薄膜在應力失配作用下，薄膜的傾斜角和尖端位移的幾何關系如圖2(b)，有

圖2 雙層材料薄膜受力的幾何尺寸。 (a) 雙層材料變形示意；(b) 幾何參數Fig.2 Geometric illustration of a bimorph.(a)Deformation of a bimorph； (b) Parameters of a bimorph.

式中，θ是薄膜尖端的傾斜角，d是尖端位移，ρ0是材料變形曲率半徑，Lb是雙晶片長度，tAl和tSiO2分別是Al 和SiO2的厚度，βb是雙層材料曲率系數。根據材料厚度和楊氏模量，計算雙層材料曲率系數。Δε是材料的應力失配，包括內部應力失配Δεin和外部應力失配Δεex，如式(3):

將式(3)帶入式(1)，得到傾斜角θ:

式中，θin為雙層材料加工過程應力變形產生的初始傾斜角，ΔθJH是雙層材料通過電流產生熱量引起的角度變化，由式(5)表示:

式中，αAl和αSiO2分別是Al 和SiO2的熱膨脹系數，ΔTJH是兩種材料焦耳熱引起的溫度變化。 根據式(1)～(5)，可得到執行器通電后的尖端位移d。

1.2 電熱型微鏡制作

微鏡的加工過程[9]如圖3 所示。 步驟如下:(1)先對清洗后的高阻硅晶片正面采用等離子增強化學氣相法(PECVD)沉積第一層1 μm 的SiO2，用濕法刻蝕形成執行器底層材料；(2)濺射一層0.2 μm 厚的Pt 并剝離作為加熱電阻層[見圖3(a)]；(3)沉積0.1 μm 厚的SiO2作為電絕緣層，再濺射1 μm 厚的Al 并剝離作為執行器的中間層[見圖3(b)]；(4)用PECVD 沉積1.2 μm 的SiO2，使用反應離子刻蝕法(RIE)刻蝕成執行器上層材料[見圖3(c)]；(5)隨后濺射0.3 μm 的Al 金屬膜，并采用剝離工藝形成微鏡面[見圖3(d)]；(6)為使雙層材料和鏡面下形成空腔，濺射一層200 nm 厚的Al2O3膜在晶片的背面，并通過濕法刻蝕形成圖形；再通過深度反應離子刻蝕法(DRIE)和RIE 刻蝕掉背面的Si 和SiO2[見圖3(e)]；(7)最后通過各向異性和各向同性DRIE 從晶片正面刻蝕去掉執行器下的硅[見圖3(f)]。

圖3 電熱型微鏡加工流程。 (a)二氧化硅和鉑層圖形；(b)鋁薄膜層濺射和剝離；(c)二氧化硅等DRIE和RIE；(d)鋁薄膜層濺射和剝離；(e)背面DRIE 和RIE；(f)正面各向異性和各向同性DRIEFig.3 Fabrication process of electrothermal MEMS mirror.(a) SiO2 and Pt patterning； (b) Sputter Al and lift-off； (c) PECVD SiO2 and RIE； (d) Sputter Al and lift-off； (e) Backside DRIE ＆ RIE； (f)Frontside anisotropic DRIE and isotropic DRIE

1.3 雙光子熒光顯微鏡探頭光學系統設計

探頭內部光學系統設計如圖4 所示。 圖4(a)為激發光路，飛秒激光器(Chameleon Vision II，Coherent，美國)輸出波長800 nm，經單模光纖(SM-920，Throlab，美國) 傳輸到探頭內，光纖末端帶GRIN 透鏡準直，輸出光斑直徑0.5 mm。 微鏡掃描范圍為± 3.5°，輸出激光以45°入射至微鏡，經微鏡反射后呈90° 偏轉，再經非球面透鏡(83606，Edmund，美國)匯聚，經過與光路呈45°放置的二向色鏡(64466，Edmund，美國)再次反射。 二向色鏡對560 nm 以上波段激光反射率達95 %，對560 nm 以下波段透過率為99.98 %。 匯聚后，激光傳播至GRIN 透鏡(64526，Edmund，美國)，該透鏡直徑1.8 mm，節距0.23，NA 為0.55，激光經GRIN 透鏡聚焦作用于樣品。 通過ZEMAX 光學軟件進行仿真，設定探頭工作距離1 mm，有效光學數值孔徑NA為0.33，理論掃描范圍為200 μm × 200 μm，橫向分辨率達到1.48 μm。 圖4(b)為熒光采集光路，樣品產生的熒光經GRIN 透鏡、二向色鏡透射，再由球面透鏡(47857，Edmund，美國)會聚至聚合物光纖(02551，Edmund，美國)，光纖直徑2 mm，數值孔徑NA 為0.5。

圖4 顯微探頭光學設計。 (a)激發光路；(b)熒光光路Fig.4 TPMP optical design.(a) Excited laser optical design； (b) Fluorescence optical design

1.4 測試實驗方法

1.4.1 電熱型微鏡性能測試

電熱型微鏡的性能包括準靜態響應和動態頻率響應。 準靜態響應是同時對所有執行器施加相同電壓測試其垂直位移。 在光學顯微鏡下，調整物鏡至圖像清晰，通過微定位記錄儀(Quadra-Chek 200，Heidenhain，德國)分別記錄鏡面和鏡架的位置，兩者之差既是鏡面相對鏡架的距離。 每改變一次電壓，記錄下鏡面位移。 動態頻率響應是對所有執行器施加同一直流信號，同時施加差分交流信號，通過跟蹤微鏡反射的激光，測試不同模式下微鏡運動的諧振頻率響應曲線。

1.4.2 雙光子熒光顯微鏡探頭成像分辨率測試

為測試雙光子熒光顯微鏡探頭成像質量，對MEMS 微結構進行成像。 測試方法為把含有熒光試劑的凝膠加入微結構凹槽，采集凹槽的熒光圖像。熒光試劑的配制采用熒光素粉末溶于乙醇，制成濃度為10 mg/mL 的熒光試劑；把0.2 mg 的瓊脂粉加入10 mL 去離子水，加熱到100℃至充分溶解形成瓊脂凝膠；在瓊脂凝膠尚未冷卻凝固前把配好的2 mL熒光試劑加入瓊脂凝膠中混合均勻，冷卻后放入冰箱避光保存。 測試前取部分凝膠均勻涂抹在微結構上，用蓋玻片壓緊，使凝膠填滿凹槽。

2 結果

2.1 電熱型微鏡性能

將電熱型微鏡置于光學顯微鏡(Olympus BX51，Olympus，日本)下觀察，其整體外形和執行器局部結構如圖5 所示。 微鏡尺寸是1.4 mm×2 mm。

圖5 微鏡。 (a)光學顯微鏡下觀察的微鏡；(b)局部放大的雙層材料執行器Fig.5 Micromirror.(a) SEM of the micromirror；(b) Zoom-in view of the inverted-series-connected bimorph actuator.

圖6(a)是測試所得微鏡的準靜態響應曲線，當施加電壓4 V 時，鏡面垂直移動距離達到132 μm。微鏡動態頻率響應測試結果如圖6(b)，第1 個頻率峰值513 Hz 代表微鏡垂直運動的諧振頻率，第2 個頻率峰值730 Hz 代表鏡面掃描形成橢圓曲線時的諧振頻率；第3 個頻率峰值823 Hz 代表鏡面掃描呈斜線模式的諧振頻率。

圖6 微鏡特性曲線。 (a)準靜態相應；(b)動態頻率相應Fig.6 Characterization of the MEMS mirror.( a ) Quasi-static response； ( b ) Dynamic frequency response.

2.2 雙光子熒光顯微鏡探頭成像效果

用3D 打印機(Ultimaker 3，Ultimaker，中國)打印出顯微鏡探頭，探頭尺寸26 mm(L)× 12 mm(W)× 8 mm(H)，重量為5.6 g。

1)MEMS 微結構成像測試:測試用的MEMS 微結構，在光學顯微鏡下的結構圖像如圖7(a)所示。微結構由5 組重復的凹槽組成，每組凹槽對應的寬度分別為5、20、30、45、52 μm。

輸出到樣品的激發光功率為150 mW。 測試得到的最小尺寸凹槽的熒光圖像如圖7(b)，圖中可以比較清晰地觀察到凹槽形狀，表明顯微鏡探頭成像的橫向分辨率至少可達到5 μm。

圖7 微結構雙光子熒光圖像。 (a)微結構；(b)熒光圖像Fig.7 Fluorescent image of micro structure.(a)Mirco structure； (b) Fluorescent image

2)生物樣品成像測試:利用該顯微鏡探頭成像系統對熒光細胞載玻片生物樣品進行成像，生物樣品是厚度16 μm 的染色小鼠腎細胞組織(F24630，Thermo Fisher，美國)，得到細胞組織的熒光圖像如圖8 所示。

圖8 小鼠腎細胞組織熒光圖像Fig.8 Fluorescent image of mouse kidney fluocells

3 討論與結論

目前探頭設計還存在不足，首先系統測試的圖像分辨率與設計理論衍射極限橫向分辨率相差較大，這可能與3D 打印探頭精度有關，打印所使用的塑料材料影響了探頭表面光潔度，雖經后期拋光處理，但還是可能影響光學器件的固定。 如采用精密機械加工，則可以明顯提高探頭的加工精度以及光學系統的對準，從而提升系統精度；另外，如選用高數值孔徑物鏡，也可以提高系統的光學分辨率。 目前探頭光學系統的結構設計以及光學器件的選擇，還有較多優化空間，有助于進一步縮小探頭尺寸和重量。

基于本設計，如要實現三維成像，尚需基于當前的二維成像系統，增加探頭的軸向調節功能，實現對生物樣品的縱向掃描。 傳統方案是采用步進電機控制顯微物鏡軸向微運動，但這樣很難實現探頭微型化。 如果采用本研究中執行器結構，把探頭物鏡與執行器粘貼，通過控制執行器進行物鏡縱向微位移，實現對組織細胞的熒光三維成像[10]。 經過前期的設計與初步測試，該方案已取得了不錯效果。

本研究設計了一種基于電熱型微鏡的雙光子熒光顯微鏡探頭，其結構尺寸26 mm(L)× 12 mm(W)× 8 mm(H)，重量5.6 g，測試結果顯示，其橫向分辨率至少可達5 μm。 未來對該探頭的進一步改進和創新，可使其成為便攜式顯微鏡成像系統的關鍵部件，成為促進解密大腦和治療神經類疾病的利器。

(致謝:感謝美國佛羅里達大學周亮博士的指導和幫助)