黑曲霉發酵產物殺松材線蟲活性研究

錢雨可，于金英，汪 冶

（1.麗水學院生態學院，浙江 麗水 323000；2.浙江理工大學生命科學與醫藥學院，浙江 杭州 310018）

松樹萎蔫病（pine wilt disease，PWD）是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner and Buhrer）Nickle（Nickle，1970），pine wilt nematode，PWN）引起的松樹病害，松樹感染松材線蟲（B.xylophilus）之后，發病初期癥狀表現為松針的黃化和萎蔫[1]。1982年我國在南京中山陵首次發現該病[2]，松材線蟲與美國白蛾、松圓蚧一同列為森林三大病源性害蟲，屬國際重要檢疫對象，其中松材線蟲被林業部列為森林害蟲之首。因此，尋找能夠高效殺滅松材線蟲的生物防治措施，保護松屬植物任務迫在眉睫。

Metcalf[3]研究發現：不僅曲霉屬真菌對線蟲具有毒殺作用，而且在工業領域中，黑曲霉（Aspergillus niger）及其次生代謝產物（如小分子有機酸、雜環化合物等[4]）在抗線蟲領域有較廣泛的應用。

筆者利用黑曲霉發酵產物，采用室內浸漬法測定其次生代謝產物對松材線蟲的毒殺作用，旨在為殺松材線蟲新型生物農藥制劑的研究和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

黑曲霉（A.niger），保存地：麗水學院生態學院天然藥物化學分析實驗室。

1.1.2 供試線蟲

采用貝爾曼（Baermann）漏斗法從馬尾松疫木中分離松材線蟲，并經浙江省林業科學研究院鑒定為B.xylophilus。對松材線蟲進行同期化處理[5]，線蟲卵經離心分離，接入長滿灰葡萄孢菌的培養基28℃恒溫培養2～3 d后得到處于L4期線蟲，用以毒力測定試驗。

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB），121℃滅菌20 min。

1.1.4 主要試劑

DMSO（AR）、乙酸乙酯（AR）、M9緩沖液、線蟲裂解液。

1.1.5 實驗設備

TG16G離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）、KS 4000i control恒溫搖床（IKA）、R-210旋轉薄膜蒸發儀（BUCHI）、旋渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）、生化培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）、SQP電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

用接種環挑取保存于試管斜面的黑曲霉劃線接種于PDA培養基，于28℃恒溫培養3～4 d，待菌落長滿整個平板。

1.2.2 發酵產物的制備

用滅菌刀切一小塊（1 cm×1 cm）長有黑曲霉菌落的培養基置于PDB中，180 r·min-1、28℃條件下培養3 d。發酵液用四層紗布過濾，取150 mL待用。剩余發酵液加入等體積乙酸乙酯萃取，上層有機相經減壓濃縮得到發酵產物，用1%DMSO溶解有機相溶質制成母液。發酵液與母液用針筒過濾器（孔徑0.22 μm）過濾除菌，置4℃冰箱備用。

1.2.3 試驗分組及毒力試驗

樣品組：將黑曲霉發酵液用無菌水稀釋0、2、4、8、16倍，各取500 μL于24孔板中。母液用1%DMSO稀 釋 至 濃 度 為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1，各取500 μL于24孔板中。

對照組：取500 μL 1%DMSO于24孔板中。

采用浸漬法[6]測定各菌株發酵產物對松材線蟲的毒殺作用。樣品組和對照組分別加入500 μL濃度為100條·mL-1的松材線蟲，于28℃條件下放置12、24、36、48 h，觀察線蟲的存活和死亡數量，并計算死亡率與校正死亡率[7-8]，每組實驗重復3次。

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel 2016軟件進行整理，運用GraphPad Prism8軟件進行數據處理與單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

經1.2.2節制備發酵產物和1.2.3節毒力實驗測定，發現黑曲霉的殺松材線蟲活性顯著，其發酵液稀釋16倍后，經12 h處理后的線蟲平均死亡率達89.04%，48 h后線蟲平均死亡率仍可達99.24%（表1）。其胞外代謝產物經24 h和48 h處理后的LC50值 分 別 為0.075 5 mg·mL-1和0.071 2 mg·mL-1，在1 mg·mL-1處理24 h后殺蟲效果即可達100%（圖1）。通過GraphPad Prism8軟件對數據進行擬合得到黑曲霉代謝產物對松材線蟲的半致死濃度及毒力回歸方程，結果見表2。

表1 黑曲霉發酵液殺松材線蟲毒力測定

圖1 黑曲霉發酵產物抗松材線蟲活性

表2 黑曲霉次生代謝產物對松材線蟲的致死濃度效應

3 討論

在眾多植物寄生線蟲生防菌中，曲霉屬真菌代謝產生的毒素對線蟲具有防治作用，其中黑曲霉作為實驗與工業上廉價易得的曲霉屬真菌廣泛應用于食品、制藥等領域。其對植物寄生線蟲的致死作用已有文獻報道，如豐波[9]研究發現黑曲霉發酵液對根結線蟲的作用為2 h致死率達94%，線蟲卵孵化抑制率達86%，且其活性物質為非蛋白質、不揮發性成分，易溶于有機溶劑。朱曉峰等[4]通過分析黑曲霉發酵液中的有機酸成分，發現其發酵液中除草酸外還有其他小分子化合物對甘薯莖線蟲和南方根結線蟲有活性。李頌等[10]研究發現黑曲霉代謝產物參與了番茄體內與防御反應相關的代謝過程，增強了番茄植株對根結線蟲病的防效。

通過黑曲霉發酵得到其次生代謝產物，并對其發酵液與萃取有機相進行室內毒力測定，首次發現其代謝產物對松材線蟲具有顯著殺蟲活性。松材線蟲經黑曲霉發酵液給藥12 h后致死率達100%，經發酵液16倍稀釋給藥12 h后致死率仍可達89.04%，與上述參考文獻中涉及的抗蟲活性無顯著差異，試驗結果具有一定的可信度。此外，發現黑曲霉的活性成分存在于發酵液萃取有機相中（萃余相經測定無明顯活性），24 h的LC50值為0.075 5 mg·mL-1，殺蟲活性優于目前治療松材線蟲病藥劑阿維菌素（IC500.134 6 mg·mL-1）[11]。

筆者對黑曲霉發酵液毒殺松材線蟲的作用進行了初步研究，今后還需要對其發酵液有機相進一步分離純化發現活性先導化合物，并對殺蟲活性成分的毒殺松材線蟲的作用機制方面進行深入研究。