紅景天苷對膿毒癥小鼠脾臟免疫功能的影響

潘夢之 趙劍秋 宋 穎 陸曉英 張贇和 胡寶吉△

（1上海市浦東醫院-復旦大學附屬浦東醫院麻醉科 上海 201399；2同濟大學附屬東方醫院重癥醫學科 上海 200120）

膿毒癥是感染導致的機體系統性炎癥反應，表現為機體各臟器功能失調［1］，目前仍是威脅人類健康的主要疾病之一。美國膿毒癥病死率高達40%，成為重癥監護病房非心臟病患者死亡的主要原因［2］；我國重癥監護病房膿毒癥發病率高達20%，90天死亡率達35.5%［3］。脾臟作為人體最大的免疫器官，是機體免疫反應的中心，脾臟內免疫功能的變化間接反應機體的免疫狀態。紅景天苷在臨床上主要用于強身健體，消除疲勞、治療抑郁或抵御高原疾病的功效。研究顯示，紅景天苷具有治療癌癥［4］、治療心血管疾病［5］、抗氧化應激及抗凋亡等作用［6］，說明紅景天苷具有潛在的臟器保護作用。紅景天苷對膿毒癥小鼠脾臟免疫功能的影響目前尚未見報道，同時尚未發現紅景天苷對其他膿毒癥動物模型中脾臟功能影響的相關報道。本研究主要探索紅景天苷對膿毒癥小鼠脾臟免疫功能的影響。

材料和方法

實驗動物與分組本實驗經復旦大學附屬浦東醫院倫理委員會批準（批文號：PDYYD20201202）后實施，實施時間為2021年4月—8月。于復旦大學附屬浦東醫院科創中心選擇健康雄性C57BL小鼠，6～8周齡，體質量（25±5）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。采用隨機數字表法分為假手術組（Sham，n=10）、對照組（CLP，n=10）和紅景天苷實驗組（SAL，n=10）。

藥物制備與給藥方案精密電子天平秤取20 mg水溶性紅景天苷顆粒（上海榮禾醫學科技有限責任公司，批號：10338-51-9，純度99.8%）20 mg，加入2 mL離心管，加入2 mL無菌生理鹽水稀釋，濃度為10 mg/mL。七氟烷麻醉下，假手術組小鼠采用開腹后關閉的假手術方法處理，對照組和實驗組采用開腹后盲腸末端結扎15G對穿盲腸末端的方法制備小鼠膿毒癥模型。假手術組和對照組試驗后尾靜脈給予100 μL無菌生理鹽水，實驗組尾靜脈給予100 μL上述紅景天苷稀釋液。給藥后，小鼠按照處理之前飼養標準進行飼養。本實驗中紅景天苷的使用方法和劑量與本團隊前期的研究一致［7-8］。

檢測指標與方法各組小鼠尾靜脈給藥后12 h，七氟烷麻醉下，將小鼠固定在手術板上，持續吸入2.5%七氟烷。取劍突下位置消毒并剪開皮膚約0.5 cm，暴露出皮下組織，剪開小鼠腹腔，取出小鼠脾臟，置入200目金屬網篩，網篩置于35 mm一次性無菌塑料培養皿中，加入1 mL 4℃1×PBS緩沖液，用剪刀剪碎組織，3 mL注射器針芯捻碎組織，使分散的細胞濾過篩網進入塑料培養皿中，用PBS緩沖液沖洗網篩，收集脾臟細胞。

ELISA檢測脾臟研磨液中細胞因子IL-6、IL-2、IL-10表達水平 參照美國eBioscience公司和美國R&D公司提供的產品說明書進行檢測。步驟如下：（1）用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至10 μg/mL，每孔加200 μL，4℃過夜。（2）移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗滌4次。（3）每孔加入100 μL樣本，4℃過夜。（4）移去樣本，每孔用洗滌緩沖液洗滌4次。（5）加入100 μL用緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，室溫保存2 h。（6）移去抗體，每孔用洗滌緩沖液洗滌4次。（7）每孔加入100 μL底物，室溫30 min。（8）每 凹 孔 加50 μL 2 mol/L的H2SO4終 止 反 應 。（9）酶標比色計測定450 nm的吸光度（D）值。

流式細胞術檢測小鼠脾臟CD4+與CD8+T細胞數量變化 步驟如下：（1）樣本準備。將脾臟研磨液用含1% BSA的PBS制成單細胞懸液，300×g離心5 min，棄掉上清液。（2）紅細胞裂解。將上一步所得細胞重懸于3 mL 1×ACK緩沖液，室溫孵育5 min后加入10 mL含1%BSA的PBS終止裂解，300×g離 心5 min，棄 掉 上 清 液 ，加 入15 mL含1%BSA的PBS重懸 細胞，300×g離心5 min，棄 上清。（3）細胞染色。按照說明書推薦用量加入熒光標記的抗體，混勻后4℃避光孵育30 min；加入1 mL含1%BSA的PBS重懸細胞，300×g離 心 細 胞 懸 液5 min，棄上清；加入200 μL 1×PBS重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測分析。

RT-PCR檢測小鼠脾臟研磨液趨化因子CXCL-10 mRNA表達水平 小鼠脾臟總RNA提取按照美國Invitrogen公司試劑盒的說明書操作步驟進行。步驟如下：（1）RNA的提取。50 mg脾臟組織研磨破碎，加入1 mL Trizol試劑；4℃，12 000×g離心10 min，轉移上清，室溫放置5 min，加0.2 mL氯仿，劇振15 s，室溫放置5 min。4℃，11 000×g離心15 min，轉移水相；水相中加入0.25 mL異丙醇及0.25 mL高鹽沉淀液（0.8 mol/L檸檬酸鈉，1.2 mol/L NaCl）混勻，室溫放置10 min。4℃，11 000×g離心10 min，棄上清加1 mL 75%乙醇，Votex混勻；4℃，7 000×g離心5 min，棄上清；沉淀在空氣中干燥15 min，用100 μL DEPC水溶解，槍頭吸打幾次，放于55℃水浴中10 min促溶。檢測吸光度（D）值，檢定RNA的量及完整性。RNA放入-70℃保存。（2）mRNA的 分 離 。 檢 測 起 始RNA的 量（≤0.25 mg）。將總RNA加入一個無RNase的1.5 mL EP管中，加入不含RNase的水至總體積為250 μL；加入250 μL的Buffer OBB和15 μL的Oligotex懸浮液，完全混合溶液；樣品溶液放入70℃水浴中保溫3 min。從水浴中取出樣品溶液，室溫下放置10 min。將樣品溶液以10 000×g離心3 min，沉淀Oligotex-mRNA復合物，用移液器小心除去上清液。用渦旋振蕩器（Votex）將Oligotex-mRNA復合物沉淀重懸于500 μL緩沖液中，然后加入到1.5 mL微量離心管中，10 000×g離心3 min。轉移到一個新的不含RNA酶的1.5 mL微量離心管中，然后加入500 μL緩沖液，10 000×g離心3 min，棄上清。加入100 μL緩 沖 液 重 懸Oligotex-mRNA復 合 物 ，10 000×g離心3 min。（3）RT-PCR。按照說明書配制RT-PCR反應液；設定反應條件。

統計學分析采用SPSS19.0軟件進行統計分析，正態分布的計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析（LSD），P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

紅景天苷可降低脾臟中細胞因子表達采用ELISA檢測小鼠脾臟中細胞因子表達水平，結果顯示：對照組的IL-6表達水平為（56.87±1.73）pg/mL，高于假手術組的（21.13±1.60）pg/mL；對照組的IL-2表達水平為（121.00±6.40）pg/mL，高于假手術組的（23.74±1.99）pg/mL；同時對照組IL-10的表達水平為（146.72±6.88）pg/mL，高于假手術組的（36.99±2.70）pg/mL，說明作為膿毒癥實驗模型的小鼠脾臟中上述細胞因子的表達水平顯著升高（P＜0.01，圖1）。與對照組相比，實驗組小鼠脾臟細胞因子IL-6、IL-2和IL-10表達水平分別為（35.78±1.83）pg/mL、（41.83±1.77）pg/mL和（66.64±3.36）pg/mL，均 顯 著 低 于 對 照 組（P＜0.01，圖1），提示紅景天苷可顯著降低膿毒癥小鼠脾臟中上述細胞因子的表達水平，具有潛在的臟器保護作用。

圖1 各組小鼠脾臟細胞因子IL-6、IL-2和IL-10表達量比較Fig 1 Expressions of cytokines IL-6，IL-2 and IL-10 in mice spleen

紅景天苷可降低脾臟中淋巴細胞浸潤采用流式細胞分析術標記小鼠脾臟中CD4+T與CD8+T淋巴細胞。結果顯示，對照組小鼠脾臟CD4+T細胞水平為（11.43±0.711）×104/μL，高于假手術組的（3.94±0.27）×104/μL，CD8+T細 胞 水 平 為（41.38±1.92）×104/μL，高于假手術組的（10.92±0.46）×104/μL。提示在膿毒癥模型中，小鼠脾臟中CD4+T和CD8+T淋巴細胞數量顯著增加（P＜0.01，圖2），淋巴細胞參與脾臟中炎癥反應過程。為明確紅景天苷是否可以通過調節淋巴細胞的浸潤，改善脾臟中炎癥反應，本實驗進一步檢測紅景天苷組淋巴細胞水平。與對照組相比，實驗組小鼠脾臟CD4+T細胞水平為（7.13±0.45）×104/μL，CD8+T細胞水平為（28.68±2.71）×104/μL，顯著低于對照組（P＜0.01，圖2），說明紅景天苷可降低CD4+T與CD8+T淋巴細胞在膿毒癥小鼠脾臟中的浸潤。

圖2 各組小鼠脾臟CD4+T與CD8+T淋巴細胞數量比較Fig 2 Amount of CD4+T and CD8+T lymphocytes in mice spleen

紅景天苷可降低趨化因子的表達為進一步明確紅景天苷在膿毒癥中的潛在機制，本實驗采用RT-PCR檢測小鼠脾臟中趨化因子的變化水平，以明確紅景天苷是否參與調節淋巴細胞在脾臟中的浸潤作用。CXCL-10屬于CXC趨化因子家族成員 ，又 名 γ 干 擾 素 誘 導 蛋 白10（IP10），與 受 體CXCR-3結合后，在感染的宿主防御過程中發揮免疫介導作用。當T細胞被激活后，在炎癥部位分泌TNF-γ誘導的趨化因子（如CXCL10等），在趨化因子的作用下，募集更多活化的T細胞向炎癥部位聚集，形成級聯放大效應。本實驗結果顯示，對照組小鼠脾臟CXCL-10 mRNA水平是假手術組的（106.26±4.10）倍，說明膿毒癥小鼠模型中，趨化因子CXCL-10的表達水平顯著升高（P＜0.01，圖3），趨化因子CXCL-10參與調節淋巴細胞在脾臟中的浸潤作用；而紅景天苷組小鼠脾臟CXCL-10 mRNA表達水平僅是假手術組的（43.91±1.52）倍，顯著低于對照組（P＜0.01，圖3），說明紅景天苷可下調趨化因子在膿毒癥小鼠脾臟中的表達水平。

圖3 各組小鼠脾臟CXCL-10 mRNA表達量比較Fig 3 mRNA expression of CXCL-10 in mice spleen

紅景天苷可降低外周血中細胞因子表達膿毒癥為系統性全身炎癥反應，本實驗在關注小鼠脾臟中炎癥反應的同時，發現小鼠外周血中細胞因子的表達水平發生顯著的變化。根據ELISA檢測結果顯示，對照組膿毒癥小鼠血漿中IL-6表達水平為（76.46±4.20）pg/mL，高于假手術組的（18.42±1.62）pg/mL；對 照 組IL-2表 達 水 平 為（33.07±3.42）pg/mL，高于假手術組的（5.66±0.57）pg/mL；對照組IL-10表達水平為（107.49±4.75）pg/mL，高于假手術組的（39.51±2.08）pg/mL。說明在膿毒癥小鼠模型中，外周血中上述細胞因子的表達水平顯著升高（P＜0.01，圖4）。與對照組相比，實驗組小鼠血漿中細胞因子IL-6為（35.44±2.81）pg/mL、IL-2為（24.10±2.14）pg/mL，IL-10為（79.09±5.78）pg/mL，均低于對照組，說明紅景天苷可顯著降低膿毒癥小鼠外周血中細胞因子的表達水平（P＜0.01，圖4）。

圖4 各組小鼠外周血中細胞因子IL-6、IL-2、IL-10表達量比較Fig 4 The expression of IL-6，IL-2 and IL-10 in mice plasma

討 論

膿毒癥是機體對感染反應失調而致危及生命的器官功能障礙［9］，病理生理過程十分復雜，目前尚未闡明確切機制。膿毒癥伴隨著炎癥風暴［1］，大量炎癥因子侵入血液系統，導致多臟器功能失調。因此，對膿毒癥時炎癥因子的研究有望進一步揭示膿毒癥的病理過程。機體炎癥反應和免疫功能紊亂是膿毒癥發生和發展的中間環節。鑒于膿毒癥病理生理的復雜性，任何動物模型均不能完整模擬人類膿毒癥的發病過程及嚴重程度［10］。目前模擬人類膿毒癥的動物模型主要分為兩類：一是脂多糖模型，通過注射外源性脂多糖毒素實現；二是盲腸結扎穿孔模型，通過改變動物內在的保護屏障實現［11］。本實驗采用常用的盲腸結扎穿孔模型，在該模型中細胞因子的變化與人類膿毒癥相似［8］。

紅景天苷提取于景天科植物大花紅景天的干燥根及根莖，具有抗癌、抗氧化、抗炎和免疫調節等多種功效［12］，有研究提示其在改善神經炎癥［13］、抑制腎纖維化［14］、改善脂肪肝［15］、抑制癌細胞增殖［16］等方面均發揮顯著作用。在氣道、脂肪組織和心肌方面同樣具有很好的抗炎作用［13］。因此，本研究者推測紅景天苷對膿毒癥具有潛在的治療作用。

脾臟是人體最大的次級淋巴器官［17］，也是炎癥反應、造血和清除紅細胞等作用的“主戰場”［18］，因其獨特的解剖結構而成為循環系統、網狀內皮系統和免疫系統的紐帶［19］。因此，研究脾臟中免疫功能變化，對了解和治療膿毒癥起到至關重要的作用。膿毒癥時機體免疫系統被強烈激活，形成廣泛的生物級聯反應，涉及大量細胞、炎癥因子和趨化因子等參與。其中，炎癥因子TNF-α、IL-6、IFN-γ 等［20］大量釋放。本實驗研究發現，膿毒癥小鼠脾臟中上述炎性因子和抑制因子IL-10表達均顯著升高，說明膿毒癥時炎性反應增強的同時，伴隨著炎性抑制的提高。采用紅景天苷處理后，上述炎性因子和抑制表達量均顯著下降，提示紅景天苷能夠抑制膿毒癥時小鼠脾臟中的炎癥反應，進而對小鼠脾臟免疫功能具有一定的調節作用。

免疫細胞功能在膿毒癥病理生理過程中起著關鍵作用。大量實驗研究證實，膿毒癥時淋巴細胞大量增加［21-22］。本研究發現膿毒癥小鼠脾臟趨化因子CXCL-10表達量顯著增加，說明脾臟中大量表達的炎性因子與顯著聚集的炎性細胞存在相關性，而本研究進一步發現T細胞數量的確明顯升高。我們推測，膿毒癥時小鼠脾臟在細胞因子的作用下，通過大量表達的趨化因子進一步募集更多的炎性細胞，增加細胞因子的表達。本實驗同時發現，紅景天苷組小鼠脾臟趨化因子CXCL-10與T細胞數量均顯著下降，進一步說明，紅景天苷可通過抑制小鼠脾臟中趨化因子的表達，進而降低膿毒癥小鼠脾臟免疫細胞浸潤，改善膿毒癥小鼠脾臟免疫狀態。

B細胞是一種在適應性免疫反應中起關鍵作用的白細胞，可生成抗體、充當抗原遞呈細胞、轉化成記憶細胞、分泌細胞因子等作用。即B細胞在體液免疫和抗原呈遞方面發揮著舉足輕重的作用。大多數B細胞都在骨髓中發育，隨后在次級淋巴器官（如脾臟或淋巴結）中發育成熟后最終在血液中循環。對于B細胞而言，脾臟是細胞活化的地方，而其發揮免疫功能的主要場所在血液循環中。因此，我們在研究脾臟中免疫功能變化時，未納入B細胞的研究。

盡管本研究初步探究了紅景天苷對膿毒癥小鼠脾臟免疫功能的影響，但是仍然存在一定的局限性：（1）Treg是一類具有免疫抑制和免疫耐受作用，以表達Foxp3、CD25、CD4為細胞表型特征的T細胞亞群。自身免疫性疾病中，自身免疫力超常表達，造成機體損害。此時Treg細胞在各種免疫細胞亞群中通過胞間接觸和分泌抑制性細胞因子，對機體的免疫反應起到負性調節作用，抑制機體免疫反應和對自身抗原的主動耐受，從而避免自身免疫疾病的發生和發展［23］；Treg同時可分泌細胞因子（如IL-10、TGF-β等）抑制自身炎癥反應，防止因免疫力超常表達引起組織破壞的病理性免疫應答。在脾臟中CD4+T細胞約占T細胞總數的46%～78%，CD8+T細胞約占13%～45%，CD4+CD8+T細胞約占1%～12%。脾臟中T細胞主要存在上述3種亞型［24］。本研究只標記了CD4+和CD8+T細胞在脾臟中的變化，發現CD4+T細胞在脾臟中數量顯著增加，同時IL-10表達量也顯著增加，在某種程度上說明Treg（CD4表型亞群）參與了炎癥反應過程。由于CD4+T細胞分為Th1、Th2和Treg，本實驗未具體區分上述各亞群細胞在膿毒癥反應過程中的具體 作 用 。（2）CXCL-10屬 于CXC趨 化 因 子 家 族 成員，與受體CXCR-3結合后，在感染的宿主防御過程中發揮免疫介導作用。當T細胞被激活后，在炎癥部位分泌TNF-γ誘導的趨化因子（如CXCL-10等），在趨化因子（如CXCL-10）的作用下，募集更多活化的T細胞向炎癥部位聚集，形成級聯放大效應。本研究發現小鼠脾臟中T細胞數量顯著增加，可能與趨化因子表達升高有關；CXCL-10 mRNA表達水平升高，可為上述猜想提供佐證。但是mRNA水平較蛋白水平證據等級低，這也是本研究的局限性之一。如證實CXCL-10在T細胞募集中的作用，除檢測CXCL-10在脾臟中蛋白質水平外，還需要進一步檢測上游TNF-γ和下游CXCR-3等蛋白質水平，以及TNF-γ作用T細胞后CXCL-10產生的水平等，這也是本團隊下一步的研究方向。

綜上所述，本研究發現，膿毒癥小鼠脾臟中炎性因子和趨化因子表達顯著升高，炎性細胞大量浸潤。采用紅景天苷治療后，膿毒癥小鼠脾臟中趨化因子表達水平顯著下降，炎性因子及炎性細胞數量均顯著下降，即紅景天苷可通過調節趨化因子的表達，降低膿毒癥小鼠脾臟炎性細胞的浸潤，進而降低膿毒癥小鼠脾臟細胞因子表達水平，改善膿毒癥小鼠脾臟免疫功能狀態，說明紅景天苷對膿毒癥小鼠有很好的治療作用，值得進一步深入研究。

作者貢獻聲明潘夢之 研究設計，數據整理，統計分析，論文撰寫。趙劍秋，張贇和 實驗設計和指導。宋穎 數據采集，論文修訂。陸曉英論文構思，數據采集。胡寶吉 論文修訂、審閱和投稿。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。