DRD2啟動子低甲基化通過ERK通路調控乳腺癌細胞增殖

鐘 明 袁 浩 錢豐源 朱紅波 伍 雯 蔣曉飛 游慶華 李永平△

（1上海市浦東醫院-復旦大學附屬浦東醫院乳腺外科，2病理科 上海 201399）

乳腺癌的治療仍然具有挑戰性［1］。部分腫瘤細胞具有較強的自我更新能力，可產生類似干細胞的異質性癌細胞［2］，被定義為癌癥干細胞（cancer stem cell，CSC）［3］。雖然對其表面標記物的分離和鑒定仍存在爭議，但這些CSC樣細胞是一種高度惡性的腫瘤細胞。實驗證據表明，傳統化療藥物對這些高度惡性的人類癌細胞無效［4］。因此，研究這類高度惡性癌細胞的作用機制，篩選靶向藥物對乳腺癌的治療具有重要意義［5-6］。

多巴胺受體（dopamine receptor，DR）是CSC樣細胞的潛在生物標志物，表達于乳腺癌CSC樣細胞而非造血干細胞。氟哌啶醇是一種DR拮抗劑，可以抑制癌癥進展，但也有研究表明氟哌啶醇可顯著刺激大鼠乳腺癌的生長［7］。這種矛盾的結果提示藥物應該同時基于分子信號通路而不僅僅是替代的表型標記物［8］。

DRD2是DR家族中的一個亞型［9-10］，其表達水平既受上游因子調控，也受啟動子甲基化的調控。原發性乳腺腫瘤表現出多種異常的DNA甲基化模式，其中一些影響轉錄［11-12］。本研究旨在是探究DRD2甲基化水平對乳腺癌細胞增殖的影響，并通過體內外實驗探索可能存在的信號通路。

材料和方法

研究對象收集2017年8月—2018年4月就診于復旦大學附屬浦東醫院的7例原發浸潤性乳腺癌患者的腫瘤組織和正常配對組織。納入標準：乳腺癌患者術前未行化療、放療等其他治療；術后病理證實為浸潤性癌。排除標準：非浸潤性乳腺癌；重要臟器功能不全；有疾病相關用藥史。患者的臨床特征見表1。本研究經過復旦大學附屬浦東醫院倫理委員會批準（批準號：QWJWXKJS-05），所有患者簽署知情同意書。

表1 入選Illumina 850K微珠芯片檢測患者的臨床特征Tab 1 Clinical characterizations of patients enrolled for Illumina 850K Beadchip detection

DNA甲基化實驗與分析使用DNeasy血液和組織試劑盒從新鮮組織中提取DNA（德國Qiagen公司）。每個樣品取500 ng DNA用EZ DNA甲基化試劑盒（美國Zymo Research公司）進行亞硫酸氫鹽轉化，將轉化后的產品放入Illumina人類甲基化850K芯片中測序。

數據主要使用R軟件和ChAMP軟件包進行分析。DNA甲基化水平以每個CpG位點的β值和調整后的P值進行評估（adj.P），均采用Benjamini-Hochberg方法 計算。具 有 δ-β 的CpGs＞0.20和adj.P＜0.05作為差異甲基化區域CpGs（differential methylated CpGs，DMC）。

細胞培養人乳腺癌細胞系（MDA-MB231、MCF7、sk-BR3）和乳腺正常細胞（Hs 578Bst）購自中國科學院細胞庫。細胞常規培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基和100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液中，溫度為37℃，濃度為5% CO2。

質粒的構建和病毒轉染構建包含DRD2編碼序列的慢病毒質粒（基因ID：1813），并將其轉染到不表達DRD2的人乳腺癌細胞中。空白質粒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro作為對照。對DRD2表達最多的人乳腺癌細胞進行DRD2特異性shRNA處理。以DRD2為靶點的shRNA序列（5’-3’）如下：shRNA1，GAATCTGTCCTGGTATGATGA（DRD2-homo-366）；shRNA2，GCTGTACAATACGCGCTACAG（DRD2-homo-774），shRNA3，GCAAGCGAGTCAACACCAAAC（DRD2-homo-1013）。非靶標shRNA作為對照（shNC）。用聚乙烯亞胺（PEI，23966-1，美國Polysciences公司）將慢病毒包裝在293T細胞中。病毒上清轉染細胞，置于含5 g/mL聚胺的無血清培養基中（40804ES76，上海翊圣生物科技有限公司）。2 μg/mL嘌呤霉素（A1113802，美國Gibco公司）篩選獲得穩定表達細胞。

Western blot分析在放射免疫沉淀法（RIPA）緩沖液（P0013C）中添加蛋白酶抑制劑（P1005）對細胞或組織進行裂解。分離的蛋白通過SDS-PAGE（P0015L）電泳，并電轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（IPVH00010，美國Millipore公司）。使用DRD2（SC-5303，美 國Santa公 司）、ERK（4695S，美 國CST公司）、p-ERK（4370S，美國CST公司）和αtublin（66031-1 ig，美國Proteintech公司）的抗體進行Western blot分析。

細胞增殖實驗細胞增殖檢測采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8，C0038，上海碧云天生物技術有限公司）。重懸細胞密度5×104/mL，每孔接種100 μL于96孔板上。用微孔板閱讀器（RT-6100，深圳雷杜生命科學股份有限公司）測定450 nm處的吸光度。

細胞體外遷移實驗在細胞遷移試驗中，將200 μL（5×104/mL）無血清細胞培養基（DMEM）稀釋處理后的細胞加入小室的上腔（353097，美國Corning公 司），將500 μL含10%胎 牛 血 清 的DMEM加入下腔。培養48 h，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.1%甲酚紫染色5 min，水沖洗。用棉簽除去上腔室中的細胞，利用相差顯微鏡對膜下的細胞進行成像。

動物模型將BALB/c-nu裸鼠（5周，雌性）分為MCF-7-NC組、MCF-7-OE組、MB231-shNC組、MB231-shRNA組 和MB231-shRNA+5-AzadC組，每組至少4只。各組小鼠左腋下乳腺脂肪墊皮下注射細胞（50～106個細胞，100 μL PBS）。兩周后，MB231-shRNA+5-AzadC組腹腔注射DNA甲基化抑制劑5-aza-2-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-AzadC，5 mg/kg，A119533，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），每周3次，連續3周。每周測量腫瘤體積，5周后處死動物。

免疫組織化學法動物模型組織標本采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。玻片以抗ki67（1∶1 000，27309-1-AP，美 國Proteintech公 司）和 抗CD31［1∶75，abs119772，愛必信（上海）生物科技有限公司］為主要抗體，非特異性免疫球蛋白IgGs作為陰性對照。

RNA提取和實時PCR使用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）從培養的細胞中提取總RNA。第一鏈cDNA合成后，使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）（上海翊圣生物科技有限公司）進行實時定量PCR。PCR擴增，循環參數為：95℃，5 min；95℃10 s，55℃20 s和72℃20 s，40個循環，最終在72℃下延長5 min。以β-actin為對照，用ΔΔCt方法計算基因表達量。DRD2基因的引物為5’-TCAGAGGTTCTTTGAGGGA-3’（正向）和5’-AAGGGAAACAGGAGAGAGG-3’（反向），β-actin基 因 的 引 物 為5’-CTGGAACGGTGAAG GTGACA-3’（正 向）和5’-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3’（反向）。

統計學分析使用GraphPad Prism 8.0進行計算和繪圖。Western blot、細胞增殖分析、細胞遷移分析、腫瘤重量和體積比較采用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

乳腺癌DRD2啟動子的低甲基化在癌組織中發 現DRD2啟 動 子 區8個CpGs（包 括TSS上 游1500 nt和5個UTR）的甲基化水平與癌旁組織相比顯著分化（adj.P＜0.05）。所有這些DMCs在腫瘤組織 中 均 發 生 低 甲 基 化 ，δ-β 值 從-0.504 9降 至-0.242 6（圖1）。

圖1 乳腺癌組織DRD2啟動子區（C1-C7）與癌旁組織（N1-N7）的DMCs識別Fig 1 DMCs identified in DRD2 promoter region of breast cancer tissues（C1-C7）to the paired adjacent tissues（N1-N7）

乳腺癌細胞株上調DRD2的表達采用qRTPCR和Western blot檢測DRD2基因在乳腺癌細胞系MCF-7、SK-BR3和MB231中的表達水平。與正常乳腺細胞相比（Hs 578Bst），在3種乳腺癌細胞中，DRD2表達量最高的是MB231細胞，而DRD2在MCF-7細胞中的表達未見明顯升高（圖2A、B）。用MCF-7構建穩定的DRD2過表達細胞，用MB231構建穩定的DRD2下調細胞。

從MCF-7細胞中構建過表達DRD2的穩定克隆（圖2C、D）。用3種不同的DRD2 shRNAs轉染MB231細 胞，其中shRNA2對DRD2表 達的 下 調 作用最顯著。最后，利用DRD2 shRNA2建立了穩定的DRD2下調的克隆（圖2E、F）。

圖2 DRD2在乳腺癌細胞中的表達水平Fig 2 Expression levels of DRD2 in breast cancer cells

DRD2促進乳腺癌細胞的增殖和遷移分別用CCK-8和遷徙實驗檢測細胞的增殖和遷移能力。

甲基化抑制劑5-AzadC的最佳濃度為10 μmol/L（圖3A），用于CCK-8試驗。DRD2過表達的MCF-7細胞的增殖率和遷移率均顯著高于正常MCF-7細胞（圖3 B-D）。同時，DRD2下調的MB231細胞的增殖率和遷移率均明顯低于正常MB231細胞（圖3E-G）。我們觀察到5-AzadC可以部分逆轉DRD2下調對乳腺癌細胞增殖和遷移的抑制作用（圖3E、G）。

圖3 DRD2促進乳腺癌細胞的增殖和遷移Fig 3 DRD2 promotes proliferation and migration of breast cancer cells

DRD2在體外調節ERK磷酸化水平Western blot法檢測DRD2過表達或低表達對ERK磷酸化水平（p-ERK）的影響。我們發現p-ERK的表達水平與DRD2的表達水平同步變化（圖4）。甲基化抑制劑（5-AzadC）可以部分逆轉DRD2下調引起p-ERK的抑制（圖4F-H）。

圖4 DRD2通過ERK信號通路促進腫瘤發生Fig 4 DRD2 promotes cancer through ERK signaling pathway

DRD2在體內調控乳腺癌進展通過體內分析發現，DRD2過表達促進了小鼠模型腫瘤組織的生長，并促進了Ki67和CD31的表達（圖5A～C）。同樣，下調DRD2的表達抑制了腫瘤的生長，也抑制了小鼠模型腫瘤組織中Ki67和CD31的表達；腹腔注射5-AzadC可部分逆轉DRD2下調引起的腫瘤生長抑制（圖5D-F）。

圖5 DRD2在小鼠體內的表達調控腫瘤的生長Fig 5 Expression of DRD2 in mice regulated tumor growth

從皮下腫瘤組織中提取蛋白，檢測ERK信號通路中蛋白的表達，結果與體外實驗相似，DRD2和p-ERK的表達水平也呈現相同的趨勢（圖6）。添加甲基化抑制劑（5-AzadC）部分逆轉了DRD2表達下調的抑制作用（圖6C、D）。

圖6 DRD2在小鼠體內通過ERK信號通路促進腫瘤發生Fig 6 DRD2 promotes cancer through ERK signaling pathway in mice

討 論

DRD2在多種癌癥中均有上調，其拮抗劑在細胞培養和動物模型中均有抗癌作用［8，13］。本研究發現，上調DRD2的表達可以提高腫瘤細胞的增殖能力和侵襲能力，而下調DRD2的表達具有抑制作用。體外實驗也表明DRD2過表達促進了腫瘤組織的生長及Ki67和CD31的表達，提示DRD2在促進腫瘤細胞增殖和遷移中起到了一定的作用，DRD2是乳腺癌潛在的驅動基因。此前有報道稱DRD2與多種信號通路相關（如ERK通路），而ERK通路對癌癥至關重要［13-14］。本研究表明DRD2在ERK信號通路中發揮作用，這意味著DRD2配體可能是一種新的癌癥治療方向。

基因表達水平還受基因啟動子甲基化狀態的影 響［15］。 有 研 究 表 明 ，DNA甲 基 轉 移 酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）在乳腺腫瘤中表達上調，缺失DNMT1對小鼠乳腺腫瘤具有保護作用［16］。本研究發現，乳腺癌組織中DRD2啟動子發生低甲基化，可能導致DRD2基因表達增加。體內和體外的實驗表明，5-AzadC可以部分逆轉DRD2敲減對細胞增殖和遷移的抑制作用。因此，在治療DRD2過表達乳腺癌的過程中，除了直接針對靶向基因表達外，我們還可以通過調控癌細胞的DNA甲基化狀態來實現。

DRD2同樣受上游通路影響，比如DRD2的表達水平可能受到肌動蛋白結合蛋白絲蛋白A（filamin A，FLNA）的調控［17］。最初認為FLNA是與乳腺癌發展有關的致癌蛋白［18］，FLNA可能通過FLNA-DRD2-ERK信 號 通 路 促 進 腫 瘤 的 發 生［17］。因此，FLNA促進乳腺癌發展是否與DNA甲基化相關，是否存在潛在靶向DRD2或ERK通路，值得今后進一步探索。本研究樣本量較少，發現在三陰性和Her-2陽性乳腺癌中，DRD2啟動子去甲基化更加明顯。后期可以通過大樣本量來細分不同分子亞型的甲基化模式對乳腺癌增值和遷徙的影響。

綜上所述，研究發現DRD2通過ERK信號通路參與乳腺癌細胞的增殖和遷移。除了之前報道的上游因子外，DRD2的表達水平還取決于其啟動子區的甲基化水平。我們的研究結果提示，治療不但要關注DRD2的抑制或激活，更應該將DRD2啟動子的甲基化狀態及其在ERK信號通路中的作用作為重要考量的因素。

作者貢獻聲明鐘明，袁浩 實驗設計和執行，數據采集和分析，論文撰寫和修訂。錢豐源，伍雯，蔣曉飛 數據采集和分析，可行性分析。朱紅波，游慶華 實驗設計，圖表繪制。李永平 研究指導，論文修正。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。