剪切波超聲彈性成像定量評價新西蘭白兔陰莖海綿體纖維化程度的可行性

饒宛婷 張雪瑩 申宜昊 陶秀紅 邢晉放

（上海市浦東醫院-復旦大學附屬浦東醫院超聲醫學科 上海 201399）

陰莖海綿體纖維化是陰莖組織的常見及多發病變，高脂血癥、糖尿病和高血壓等多種疾病均可導致陰莖海綿體纖維化［1-3］，因此，準確評估陰莖海綿體的纖維化程度具有重要臨床意義。目前，臨床只能通過組織活檢技術檢測相關病理學指標來定量評估陰莖海綿體的纖維化程度。組織活檢屬有創性檢查，可引起陰莖血腫、硬結和疼痛等并發癥，存在影響勃起功能的風險［4］；同時，作為外生殖器，陰莖組織活檢等有創檢查的臨床應用前景十分受限，亟需探索適用于臨床定量評估陰莖海綿體纖維化程度的無創方法。剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）是一項剛剛應用于臨床定量分析陰莖組織病變的超聲新技術。初步研究發現，SWE可定量評估陰莖海綿體的硬度、鑒別動脈性勃起功能障礙和非動脈性勃起功能障礙以及診斷陰莖硬結癥［5-8］；同時，利用SWE進行肝纖維化定量評估的臨床價值已獲得國內外學者的共識［9-10］。目前，鮮見有關SWE能否準確定量評價陰莖海綿體的纖維化程度的研究報道，故本研究試圖通過動物實驗探索利用SWE定量評價新西蘭白兔陰莖海綿體纖維化程度的可行性。

材料和方法

主要試劑3%戊巴比妥鈉、PBS緩沖液、TBS緩沖液（國藥集團上海化學試劑有限公司）；重組人轉換生長因子 β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）（100-21-10，美國Pepro Tech公司）；無水乙醇、二甲苯、蘇木精染液、伊紅染液、Scott藍化液、檸檬酸鈉緩沖液、DAB試劑盒（上海邁新生物技術有限公司）；抗纖維連接蛋白（fibronectin，FN）抗體、抗Ⅲ型膠原纖維（collagen typeⅢ，ColⅢ）抗體（NBP1-51723和NBP1-5119SS，美國Novus公司）。

檢查儀器Aixplorer超聲診斷儀、SL 15-4探頭（美國HOLOGIC公司），組織脫水機（湖北亞光醫用技術電子有限公司），病理切片機、石蠟包埋機（德國Leica公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

實驗動物本研究隨機選取不同周齡陰莖海綿體正常的雄性新西蘭白兔和陰莖海綿體發生纖維化的雄性新西蘭白兔各10只（由復旦大學附屬浦東醫院實驗動物中心提供），陰莖海綿體發生纖維化的新西蘭白兔為通過向陰莖海綿體組織內注射重組人TGF-β1構建（一次性注射13～17 μg，20天后）。實驗操作符合復旦大學附屬浦東醫院倫理委員會對動物實驗倫理的要求（實驗課題倫理編號：YJRCJJ-201804）。

SWE檢查使用3%戊巴比妥鈉（1.0 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，兔麻醉后，取仰臥位固定于加熱墊上。消毒陰莖及四周皮膚，選取陰莖橫切面進行SWE檢查；灰階圖像清晰顯示陰莖組織后，開啟SWE模式，圖像優化調節設置為“Pen”，焦點深度為2 cm，增益為30%；陰莖組織SWE圖像穩定顯示5 s后，連續存圖30 s；回放圖像，選取質量合格的圖像測量陰莖海綿體的剪切波彈性量化測值（shear wave elastic quantitative measurement，SWQ）。 質量合格的圖像標準為陰莖海綿體白膜及內部組織色彩充填完整且無馬賽克樣干擾斑點，SWQ測量感興趣區為最大程度包繞白膜外緣的圓形感興趣區，測量單位選擇kPa。所有兔的陰莖SWE檢查均由同一名從事SWE檢查工作5年以上的高年資超聲醫師在雙盲的情況下完成。

組織學分析SWE檢查完成后，即刻處死兔，并切取陰莖組織，制備厚度為3 μm的石蠟切片。

蘇木精-伊紅（HE）染色 石蠟切片經HE染色后，在光鏡下（×200）觀察陰莖海綿體組織內成纖維細胞及膠原纖維（collagen fiber，CF）的分布。

苦味酸-天狼星紅染色 石蠟切片經飽和苦味酸液-蘇木精液染色后，在光鏡下（×200）觀察，隨機選取陰莖海綿體組織內的5個視野，使用Image J軟件分析并測量CF和平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）的陽性面積占陰莖海綿體總面積的百分比，計算CF/SMC比值。

免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟及水化，PBS緩沖液浸泡，98℃檸檬酸鈉緩沖液中恒溫抗原修復30 min；0.3%過氧化氫溶液清除內源性過氧化物酶；含10%馬血清及1%牛血清白蛋白的TBS緩沖液室溫下孵育1 h，以封閉非特異性抗原；滴加經TBS緩沖液稀釋的一抗溶液（1∶50稀釋的抗FN抗體、1∶100稀釋的抗ColⅢ抗體），于濕盒中4℃過夜孵育；滴加含1%牛血清白蛋白的TBS緩沖液稀釋的二抗，室溫孵育2 h；DAB顯色，蘇木精復染細胞核3 min，沖洗、分化、脫水和透明后封片。光鏡下（×200）觀察切片，隨機選取陰莖海綿體組織內的5個視野，使用Image J軟件分別計算FN和ColⅢ的陽性區域占陰莖海綿體總面積的百分比。組織切面圖像分析由病理學專業技術人員完成。

統計學方法使用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。定量資料用表示。對定量資料（周齡、體質量和SWQ）進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊的資料采用兩獨立樣本t檢驗進行比較，不符合正態分布和（或）方差不齊的資料則采用曼-惠特尼秩和檢驗進行比較。選用Spearman秩相關檢驗對兔陰莖海綿體的SWQ與CF/SMC、FN和ColⅢ進行相關性分析。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一般資料10只陰莖海綿體正常的新西蘭白兔周齡為16～24周，體質量為2.10～3.00 kg，10只陰莖海綿體發生纖維化的新西蘭白兔周齡為17～23周，體質量為2.20～2.85 kg（表1）；兩組間周齡和體質量差異無統計學意義（表2）。

表1 陰莖海綿體正常兔和陰莖海綿體纖維化兔的周齡、體質量和SWQTab 1 Age，bodyweight，and SWQ of rabbits with normal penile cavernosa and rabbits with penile cavernosa fibrosis

SWE檢查20只兔子均成功完成陰莖組織SWE檢查，并獲得合格的陰莖海綿體圖像。經SWQ測量（圖1），SWQ為（15.97±6.43）kPa（表1）；兩組間SWQ測值差異有統計學意義（P＜0.001，表2）。

圖1 新西蘭白兔陰莖海綿體的SWE圖像Fig 1 SWE images of penile cavernosa in New Zealand white rabbits

表2 陰莖海綿體正常兔和陰莖海綿體纖維化兔平均周齡、體質量和SWQ的比較Tab 2 Comparison of mean age，bodyweight，and SWQ between rabbits with normal penile cavernosa and rabbits with penile cavernosa fibrosis （）

表2 陰莖海綿體正常兔和陰莖海綿體纖維化兔平均周齡、體質量和SWQ的比較Tab 2 Comparison of mean age，bodyweight，and SWQ between rabbits with normal penile cavernosa and rabbits with penile cavernosa fibrosis （）

（1）t-test；（2）Wilcoxon rank-sum test.SWQ：Shear wave elastic quantitative measurement.

Item Age（wk）Bodyweight（kg）SWQ（kPa）Rabbits with normal penile cavernosa 19.90±2.64 2.51±0.29 9.76±0.56 Rabbits with penile cavernosa fibrosis 20.10±1.97 2.53±0.20 22.18±1.09 t or Z 0.192（1）0.179（1）-3.784（2）0.850 0.860＜0.001 P

組織學分析HE染色（圖2）顯示10只陰莖海綿體正常兔的陰莖海綿體均未發生纖維化，10只陰莖海綿體纖維化兔的陰莖海綿體均可見發生纖維化。苦味酸-天狼星紅染色（圖3）測值：CF為54.50%±13.82%，SMC為35.31%±9.04%，CF/SMC的比值為1.78±1.10。 免 疫 組 化（圖4）測 值 ：FN為22.09%±7.91%，ColⅢ為19.06%±11.13%。

圖2 新西蘭白兔陰莖海綿體組織HE染色圖像Fig 2 HE staining of penile cavernosa in New Zealand white rabbits

圖3 新西蘭白兔陰莖海綿體組織苦味酸-天狼星紅染色Fig 3 Sirius red staining of penile cavernosa in New Zealand white rabbits

圖4 新西蘭白兔陰莖海綿體組織免疫組化染色圖像Fig 4 Immunohistochemical staining of penile cavernosa in New Zealand white rabbits

相關性分析由表3可見，SWQ與CF/SMC、FN和ColⅢ均相關（P＜0.001），且呈高度正相關。

表3 SWQ與纖維化程度指標的相關性Tab 3 Spearman correlation analysis between SWQ and fibrotic indicators

討 論

本研究通過動物實驗證明，利用SWE可以對新西蘭白兔陰莖海綿體纖維化程度進行定量評價。這一研究成果對于陰莖海綿體纖維化診斷具有重要的臨床意義。陰莖海綿體纖維化是一種累及陰莖海綿體白膜的結締組織疾病，也是高脂血癥、糖尿病等多種疾病的主要并發癥之一［11］。作為一種慢性進展性病變，陰莖海綿體纖維化早期常無明顯的臨床癥狀，病變進展會引起纖維條索、硬結、彎曲和縮短，并伴有陰莖疼痛癥狀，同時導致勃起功能障礙的發生［12］。因此，準確及時評價陰莖海綿體纖維化至關重要［13］。

陰莖海綿體纖維化的主要病理生理過程為：多種病因導致陰莖海綿體內出現炎癥反應，炎性細胞積聚、氧自由基生成并釋放一系列纖維源性因子（如TGF-β1）［14］；TGF-β1對炎癥細胞（巨噬細胞、中性粒細胞）和成纖維細胞具有趨化作用，能促進成纖維細胞增殖并轉化為肌成纖維細胞，導致過量膠原蛋白沉積，CF增生［2］；FN是TGF-β1誘導陰莖海綿體纖維化過程中的重要靶蛋白，可以刺激成纖維細胞增殖并分泌大量細胞外基質（如ColⅢ）［15-17］；細胞外基質的增加會影響SMC的生長，導致SMC萎縮和凋亡、CF與SMC的比例失衡，進一步加重陰莖海綿體的纖維化程度，進而影響勃起功能［18］。根據上述病理過程可知，陰莖海綿體組織內CF/SMC比值越大、FN和ColⅢ的含量越多，陰莖海綿體的纖維化程度越重。據此，國內外學者認為［2，19-20］利用CF/SMC、FN和ColⅢ可以定量評價陰莖海綿體組織的纖維化程度。

CF/SMC、FN和ColⅢ的測定需要通過活檢獲取組織進行免疫組化等分析。由于組織活檢為侵入性有創檢查，通常可以導致陰莖血腫、纖維化和疼痛等并發癥，這些并發癥存在影響勃起功能的風險；同時，該器官的特殊性使得患者接受有創檢查的意愿更低，任何有創檢查都無法作為常規檢查方法應用于陰莖海綿體，因此探索無創評價陰莖海綿體纖維化程度的臨床檢查方法具有重要的意義。

SWE是一項可定量評價組織病變的新型超聲檢查技術，組織內成分及其含量發生變化會引起SWQ測值改變，當組織發生不同程度纖維化時，SWQ測值會同時發生相應的變化［21］。同時，國內外研究已證實，SWE可以準確進行肝臟、腎臟和肌肉等組織纖維化程度的定量評價［9，22-24］。據此推測：陰莖海綿體的SWQ也可以作為評價陰莖海綿體纖維化程度的一項定量指標。我們通過獲取不同周齡陰莖海綿體正常和陰莖海綿體發生纖維化的新西蘭白兔（周齡、體質量均無差異），利用SWE測量所有兔陰莖海綿體的SWQ；在完成SWQ測量后，立即獲取陰莖海綿體組織進行CF/SMC、FN和ColⅢ的定量測量，并分析SWQ與CF/SMC、FN和ColⅢ的相關性。結果顯示，SWQ與CF/SMC、FN和ColⅢ分別呈高度正相關。

本研究尚存在以下不足之處：用于評價陰莖海綿體纖維化程度的病理學指標僅包括CF/SMC、FN和ColⅢ，而評價陰莖海綿體纖維化程度的病理學指標還包括羥脯氨酸含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值、α-平滑肌肌動蛋白陽性面積/海綿體總面積百分比等。

CF/SMC、FN和ColⅢ是反映陰莖海綿體纖維化程度的客觀指標，本研究結果提示：SWQ是一項新的反映陰莖海綿體纖維化程度的定量指標，SWE可作為一項定量評價陰莖海綿體纖維化程度的無創新技術，值得深入研究。

作者貢獻聲明饒宛婷，張雪瑩 實驗操作，數據采集，論文撰寫和修訂。申宜昊，陶秀紅 實驗操作，數據采集。邢晉放 課題設計，實驗操作和指導，數據分析，論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。