葛根芩連湯抑制TNF-α誘導的Caco-2細胞氧化損傷配伍規律研究

林 川，董文敏，張倩蕓，劉王振祖，梁 琨，王新宏，安 叡*

葛根芩連湯抑制TNF-α誘導的Caco-2細胞氧化損傷配伍規律研究

林 川1，董文敏2，張倩蕓1，劉王振祖1，梁 琨1，王新宏1，安 叡1*

1. 上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203 2. 復旦大學附屬浦東醫院，上海 201200

探討葛根芩連湯緩解腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導的人結腸癌Caco-2細胞氧化應激損傷作用及其配伍規律。將Caco-2細胞隨機分為對照組、TNF-α（80 μg/L）組、小檗堿（6.73 μg/mL）組及葛根芩連湯配伍組（全方組、去甘草組、去葛根組、葛根甘草組和黃芩黃連組，18.75 μg/mL）。除對照組外，其余各組細胞給予TNF-α預處理2 h，再給予相應藥物處理24 h。MTT檢測Caco-2細胞活力；流式細胞術檢測細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；比色法檢測細胞中總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；qRT-PCR和Western blotting分別檢測核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，）、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，]和血紅素氧合酶-1（heme oxygenase 1，）mRNA和蛋白表達；熒光顯微鏡觀察Nrf2蛋白入核情況。5.0～25.0 μg/mL的含藥培養基和10～80 μg/L的TNF-α對Caco-2細胞活性無明顯影響。與TNF-α組比較，各給藥組Caco-2細胞ROS水平顯著降低（＜0.01）；除去葛根組和黃芩黃連組外，其余各組MDA水平顯著降低（＜0.01），GSH水平明顯升高（＜0.01）；除去葛根組外，其余各給藥組基因表達明顯升高（＜0.01），全方組和去甘草組基因表達明顯升高（＜0.05、0.01），全方組和葛根甘草組基因表達明顯升高（＜0.05、0.01）；除黃芩黃連組外，其余各組Nrf2和HO-1蛋白表達顯著升高（＜0.01）；除去葛根組和黃芩黃連組外，其余各組NQO1蛋白水平顯著升高（＜0.05、0.01），Nrf2蛋白入核明顯增加（＜0.05、0.01）。缺少葛根對葛根芩連湯抑制Caco-2細胞氧化應激損傷有較大影響。

葛根芩連湯；葛根；配伍規律；氧化應激；結腸癌細胞

氧化應激是體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，傾向于氧化，中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物。氧化應激是自由基在體內產生的一種負面作用，是導致衰老和疾病的一個重要因素。葛根芩連湯出自《傷寒論》，為醫圣張仲景的名方之一。方中葛根為君，以其甘辛而涼，主入陽明經，外解肌表之邪、內清陽明之熱，使表解里和；臣以黃芩、黃連苦寒清熱，堅陰止利；佐使以甘草甘緩和中，調和諸藥；四藥合用，外疏內清，表里同治。研究表明，葛根芩連湯對氧化應激損傷有一定的緩解作用[1-2]。本課題組前期從化學成分[3]、入血成分[4]、在人結腸癌Caco-2細胞模型中的吸收特征[5]、對肝臟細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）具體亞型酶活性的影響[6]、腸外翻吸收[7-9]、在體腸道灌流吸收及對急性腸炎大鼠腸道菌群多樣性的影響[10-11]等方面對葛根芩連湯的配伍機制進行了大量研究。本研究以人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）為刺激因素[12-13]，激活Caco-2細胞炎癥反應，觀察葛根芩連湯及不同配伍組對Caco-2細胞的影響，以及對氧化應激相關細胞因子和通路的作用，以闡釋葛根芩連湯抗氧化應激作用機制及其配伍的合理性，為更全面地揭示該復方配伍規律的研究奠定基礎。

1 材料

1.1 細胞

Caco-2細胞購自賽百慷生物技術股份有限公司。

1.2 藥材

葛根、黃芩、黃連和炙甘草飲片均購自上海康橋中藥飲片有限公司，批號分別為201016、201103、201118、201109，經上海中醫藥大學倪梁紅副教授鑒定分別為豆科植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根、唇形科植物黃芩Georgi的干燥根、毛茛科植物黃連Franch的干燥根莖和豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，符合《中國藥典》2020年版規定。

1.3 藥品與試劑

小檗堿（質量分數≥98%，批號Y18N8S48598）購自上海源葉生物科技有限公司；MEM培養基（批號20210706）、青鏈霉素混合液（批號20211119）、0.25%胰蛋白酶（批號2021060105）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批號2217479CP）購自美國Gibco公司；MTT（批號CR2107085）、β-actin抗體（批號AC2102050A）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號CR2104079）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；TNF-α（批號021825）購自PeproTech公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒（批號20201231）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒（批號20210106）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（批號20210105）購自南京建成生物工程研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號01152120319）、總RNA抽提試劑Trizol（批號030221211216）、ECL化學發光試劑盒（批號031519190503）、Triton X-100（批號120921220118）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，批號091720210121）購自碧云天生物技術公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批號027E1280LB）、HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（批號017E2232BA）購自諾唯贊公司；RIPA裂解液（批號R1001221）、BCA蛋白定量試劑盒（批號B1001231）購自上海翊圣生物公司；核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號00102781）、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，NQO1]抗體（批號10017852）、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號00083458）購自Proteintech公司；濃縮型正常山羊血清（批號17G04A09）、熒光（Cy3）標記的羊抗兔IgG抗體（批號BST16L31C17G32）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器

SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司）；FlexStation3型多功能酶標儀（Molecular Devices公司）；cytoFLEX型流式細胞儀（Beckman Coulter公司）；BioPhotometer D30型核酸蛋白檢測儀，Mastercycler pro型梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；StepOnePlus型qRT-PCR儀（美國ABI公司）；PowerPac Basic型電泳儀及Mini Transblot型濕轉印槽（美國Bio-Rad公司）；AI 600型超靈敏多功能成像儀（美國GE公司）；BX53型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 葛根芩連湯的制備

設置全方（GQ）組、去甘草（WGC）組（葛根、黃芩、黃連）、去葛根（WG）組（黃芩、黃連、甘草）、葛根甘草（GG）組、黃芩黃連（QL）組，將葛根、黃芩、黃連、甘草按照5∶3∶2∶2的比例混合（各組中缺味藥材按0計算），分別加10倍量水，葛根先煎20 min，余藥共煎30 min，煎煮2次，濾過，合并濾液，采用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）測定成分及含量[1,3]，GQ組、WGC組和GG組葛根素質量分數分別為4.86、3.78和3.14 mg/g，GQ組、WGC組、WG組和QL組小檗堿質量分數分別為6.76、0.73、6.91和1.79 mg/g。濾液于60 ℃旋轉蒸發濃縮，放至室溫后于?20 ℃冰箱預凍，轉入凍干機，真空冷凍干燥，取出并碾壓得到凍干粉。以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解凍干粉[14]，經微孔濾膜濾過，使用時以培養基稀釋。

2.2 細胞培養

Caco-2細胞用含20% FBS和1%青鏈霉素混合液的MEM培養基[15-16]，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞融合至對數生長期時進行后續實驗。

2.3 葛根芩連湯及配伍對Caco-2細胞存活率的影響

取處于對數生長期的Caco-2細胞，以5×103個/孔接種至96孔板，培養過夜。設置對照組、GQ組、WGC組、WG組、GG組和QL組，各給藥組分別以5.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的相應藥物處理24 h，對照組給予等體積培養基培養24 h。每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養4 h；棄去培養基，加入150 μL DMSO振蕩10 min，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝給藥/對照

2.4 TNF-α對Caco-2細胞存活率的影響

取處于對數生長期的Caco-2細胞，以5×103個/孔接種至96孔板，培養過夜。設置對照組和TNF-α組，TNF-α組分別以10、20、40、80、100 μg/L的TNF-α處理26 h，對照組給予等體積培養基培養26 h。按“2.3”項下方法測定各組值，計算細胞存活率。

2.5 細胞內ROS含量的測定

取處于對數生長期的Caco-2細胞，以2×105個/孔接種至6孔板，培養過夜。設置對照組、TNF-α組、小檗堿組和葛根芩連湯及其配伍組，TNF-α組給予80 μg/L TNF-α處理26 h，各給藥組給予80 μg/L TNF-α預處理2 h后，BBR組給予6.73 μg/mL小檗堿[2,17]，葛根芩連湯及其配伍組分別給予18.75 μg/mL藥液[2]，與TNF-α共同作用24 h，對照組給予等體積培養基培養26 h，按照試劑盒說明書檢測細胞內ROS水平。

2.6 細胞T-SOD活性和MDA、GSH水平的檢測

取處于對數生長期的Caco-2細胞，按“2.5”項下方法分組并給藥，收集細胞，按照試劑盒說明書檢測T-SOD活性和MDA、GSH水平。

2.7 qRT-PCR檢測Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達

取處于對數生長期的Caco-2細胞，按“2.5”項下方法分組并給藥，收集細胞，用預冷的PBS洗滌。按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析[17]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，引物序列見表1。

2.8 Western blotting檢測Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達

取處于對數生長期的Caco-2細胞，按“2.5”項下方法分組并給藥，收集細胞，用預冷的PBS洗滌。加入100 μL含1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入Loading buffer混勻，95 ℃加熱使蛋白變性，分裝后于?80 ℃保存。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后，分別加入Nrf2（1∶2000）、NQO1（1∶10 000）、HO-1（1∶1000）和β-actin（1∶3000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗（1∶3000），室溫孵育2 h，顯影后，用Image J軟件分析目的條帶灰度值[18]。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’) Nrf2F: GACAATGAGGTTTCTTCGGCTACG R: GGAGAGGATGCTGCTGAAGGAATC NQO1F: CGCAGACCTTGTGATATTCCAG R: CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG HO-1F: CAGCATGCCCCAGGATTTG R: AGCTGGATGTTGAGCAGGA β-actinF: CCTGACTGACTACCTCATGAAG R: GACGTAGCACAGCTTCTCCTTA

2.9 免疫熒光染色檢測Caco-2細胞Nrf2入核作用

取處于對數生長期的Caco-2細胞，接種于細胞爬片上，按“2.5”項下方法分組并給藥，24 h后吸棄培養板中液體，加入PBS洗滌，于4%多聚甲醛中固定，加入0.5% Triton X-100室溫通透，滴加正常山羊血清，室溫封閉。吸干封閉液，滴加Nrf2抗體（1∶50），放入濕盒，4 ℃孵育過夜。浸洗，吸干，滴加熒光（Cy3）標記的羊抗兔IgG抗體（1∶100），于37 ℃濕盒中孵育1 h。滴加DAPI，避光孵育染核。洗滌，吸干液體，加入含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察，采集圖像，使用IPP 6.0軟件對免疫熒光照片進行分析。

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 葛根芩連湯及配伍對Caco-2細胞存活率的影響

如表2所示，葛根芩連湯及其配伍在5.0～25.0 μg/mL時，Caco-2細胞存活率基本在80%及以上，說明Caco-2細胞未受到明顯影響。根據前期研究，GQ為18.75 μg/mL時[2]，對Caco-2細胞損傷緩解作用較好，因此后續實驗中葛根芩連湯及其配伍組的質量濃度設定為18.75 μg/mL。

3.2 TNF-α對Caco-2細胞存活率的影響

如表3所示，Caco-2細胞給予10～80 μg/L的TNF-α處理時，細胞存活率均大于80%，活性基本未見明顯影響。根據前期研究[2]，80 μg/L TNF-α顯著誘導細胞內促炎細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，）mRNA的表達，因此在后續實驗中選擇80 μg/L TNF-α誘導細胞損傷。

3.3 葛根芩連湯及配伍對細胞內ROS水平的影響

如表4所示，與對照組比較，TNF-α誘導后細胞內ROS水平明顯升高（＜0.01）；經藥物干預后，Caco-2細胞內ROS水平均顯著降低（＜0.01）；與GQ組比較，WG組和QL組細胞內ROS水平顯著升高（＜0.01）。

組別劑量/(μg·mL?1)細胞存活率/%組別劑量/(μg·mL?1)細胞存活率/% GQ5.091.29±1.49GG5.0110.36±1.07 12.592.65±0.85 12.5103.39±0.82 25.079.76±0.53 25.090.46±1.22 50.060.08±0.51 50.074.03±1.74 100.048.23±0.53 100.043.23±0.48 200.09.62±0.03 200.013.20±1.09 WGC5.094.79±0.33QL5.095.21±1.17 12.597.92±1.04 12.595.83±1.06 25.080.59±1.36 25.079.74±1.43 50.067.43±0.55 50.058.20±0.30 100.048.02±0.71 100.033.20±0.43 200.08.41±0.05 200.09.37±0.03 WG5.094.65±2.28 12.583.99±1.71 25.080.42±0.32 50.064.47±0.44 100.048.34±0.82 200.09.46±0.17

表3 TNF-α對Caco-2細胞存活率的影響(, n = 3)

表4 葛根芩連湯及配伍對Caco-2細胞內ROS水平的影響(, n = 3)

與對照組比較：**＜0.01；與TNF-α組比較：#＜0.05##＜0.01；與GQ組比較：&＜0.05&&＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01TNF-α group;&< 0.05&&< 0.01GQ group, same as below tables

3.4 葛根芩連湯及配伍對細胞內T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響

如表5所示，與對照組比較，TNF-α組細胞中MDA水平顯著升高（＜0.01），T-SOD活性和GSH水平顯著降低（＜0.01）；與對照組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組MDA水平顯著降低（＜0.01），GSH水平顯著升高（＜0.01）；與GQ組比較，WG組和QL組MDA水平顯著升高（＜0.01），GSH水平顯著降低（＜0.01）。

3.5 葛根芩連湯及配伍對細胞內Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達的影響

如表6所示，與對照組比較，TNF-α組mRNA表達呈下降趨勢，和mRNA表達水平均明顯降低（＜0.01）；與TNF-α組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組、GG組和QL組mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），GQ組和WGC組mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），GQ組和GG組mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與GQ組比較，WGC組、WG組、GG組和QL組和mRNA表達水平均明顯降低（＜0.01），WGC組、WG組和QL組mRNA表達水平均明顯降低（＜0.01）。

表5 葛根芩連湯及配伍對Caco-2細胞中T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響(, n = 3)

表6 葛根芩連湯及配伍對Caco-2細胞Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達的影響(, n = 3)

3.6 葛根芩連湯及配伍對細胞內Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達的影響

如圖1和表7所示，與對照組比較，TNF-α組NQO1蛋白表達呈下降趨勢，Nrf2和HO-1蛋白表達水平均明顯降低（＜0.01）；與TNF-α組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組、WG組和GG組Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組NQO1蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與GQ組比較，QL組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達水平均明顯降低（＜0.05、0.01）。

圖1 各組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達情況

3.7 葛根芩連湯及配伍對Nrf2蛋白入核影響

如圖2和表8所示，與對照組比較，TNF-α組細胞核內Nrf2蛋白陽性表達呈下降趨勢；與TNF-α組比較，小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組細胞核內Nrf2蛋白陽性表達明顯增加（＜0.05、0.01）。

表7 葛根芩連湯及配伍對Caco-2細胞Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖2 各組Caco-2細胞中Nrf2蛋白入核情況 (×400)

表8 各組Caco-2細胞中Nrf2蛋白表達 (, n = 3)

4 討論

研究發現，葛根芩連湯可上調Nrf2信號通路緩解TNF-α誘導Caco-2細胞氧化應激損傷和潰瘍性結腸炎大鼠病理損傷[1-2]。本課題組在動物實驗中初步探討了葛根芩連湯抗氧化應激作用的配伍規律，發現組方中缺少君藥葛根或僅有臣藥黃芩和黃連對減輕氧化應激損傷作用有較大影響[1]。因此，本研究以TNF-α誘導Caco-2細胞氧化損傷，進一步探討葛根芩連湯抗氧化應激作用的配伍規律。

TNF-α可以激活炎癥反應，引起氧化應激損傷，導致ROS產生大量增加[19-20]。ROS的增加會引起細胞內的脂質、蛋白質和核酸氧化，進而造成細胞氧化應激損傷，甚至會導致細胞毒性。MDA為ROS與細胞膜上不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的終產物[21]，其含量可以間接反映脂質過氧化程度。本研究結果顯示，葛根芩連湯及不同配伍組均可以顯著降低TNF-α引起的ROS含量增加，但去葛根組和黃芩黃連組降低ROS含量的作用比全方組弱且有顯著性差異。去葛根組和黃芩黃連組對TNF-α誘導的MDA含量增加無明顯降低作用。前期動物實驗[1]中，去葛根組對大鼠血清中MDA含量的降低明顯弱于全方組。表明全方中君藥葛根對于降低過氧化物含量起重要作用。

SOD可以清除機體內產生的超氧化陰離子和自由基[22]，GSH可以保護細胞膜結構和功能免受過氧化氫的氧化損傷[23]。SOD活性和GSH水平降低會導致自由基堆積[24]。本研究結構顯示，給予藥物干預后，TNF-α引起的T-SOD活性和GSH水平下降得到了改善，但去甘草組和去葛根組T-SOD活性與對照組相比具有顯著性差異，去葛根組和黃芩黃連組對GSH的作用明顯低于全方組。前期動物實驗[1]中，去葛根組大鼠血清中T-SOD活性明顯低于對照組，黃芩黃連組GSH活性與全方組相比具有顯著性差異，與本研究結果基本一致。提示葛根芩連湯能夠促進抗氧化酶活性，其中君藥葛根的作用較大。

Nrf2是機體抵抗氧化應激的關鍵調控因子，Nrf2的激活可以抑制氧化應激和炎癥反應，減少細胞凋亡[12,23-24]。NQO1同時也是輔酶Q（泛醌）和維生素E的還原酶，可通過維持輔酶Q和維生素E的還原狀態來發揮抗氧化應激作用[1-2]。HO-1是血紅素生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子的限速酶[22-23]。NQO1和HO-1是體內重要的II相解毒酶和抗氧化劑，在體內發揮著重要的抗氧化作用。本研究結果顯示，葛根芩連湯及配伍對TNF-α引起的、和mRNA和蛋白表達降低均有一定的恢復作用。其中對mRNA的促進作用，其他配伍組均弱于全方組，黃芩黃連組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達明顯低于全方組，與動物實驗結果基本一致[1]。在此基礎上，進一步研究藥物對Nrf2蛋白入核的影響，發現去葛根組和黃芩黃連組對TNF-α導致的Nrf2蛋白入核減少沒有明顯改變。上述結果證實缺少葛根的配伍組激活Nrf2信號通路作用較弱。

本課題組前期研究發現，對于TNF-α誘導的氧化應激損傷，葛根素、黃芩苷、小檗堿和甘草苷均具有一定的抑制作用，其中葛根素和小檗堿的抗氧化應激作用相對較好[2]。本研究以小檗堿為陽性對照藥物，質量濃度為6.73 μg/mL，但去葛根組和黃芩黃連組中所含小檗堿僅有0.13和0.03 μg/mL，因此去葛根組和黃芩黃連組盡管含小檗堿成分，由于含量低導致其抗氧化應激作用與全方組相比有明顯差異，同時這2個配伍組又不含有葛根素，這也是抗氧化應激作用弱的又一原因。

以上研究結果表明，葛根芩連湯及不同配伍對TNF-α誘導的氧化應激損傷均有一定的抑制作用。綜合細胞實驗和動物實驗[1]結果，方中缺少君藥葛根對抗氧化應激作用有明顯影響。然而葛根芩連湯抑制氧化應激損傷的配伍規律及其藥效物質基礎還有待通過在體實驗進一步驗證。本課題組將進一步展開葛根芩連湯抗氧化應激損傷的有效成分研究，深入探討葛根芩連湯配伍規律的物質基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Combination rule of Gegen Qinlian Decoction on inhibiting oxidative damage stimulated by TNF-α in Caco-2 cells

LIN Chuan1, DONG Wen-min2, ZHANG Qian-yun1, LIU Wang-zhenzu1, LIANG Kun1, WANG Xin-hong1, AN Rui1

1. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Pudong Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 201200, China

To investigate the effect of Gegen Qinlian Decoction (葛根芩連湯) on relieving tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced oxidative stress injury in human colon cancer Caco-2 cells and its compatibility.Caco-2 cells were randomly divided into control group, TNF-α (80 μg/L) group, berberine (6.73 μg/mL) group and Gegen Qinlian Decoction compatibility group [Gegen Qinlian group (GD), Gancao (et) absent group (WGC), Gegen () absent group (WG),-etgroup (GG), Huangqin ()-Huanglian () group (QL), 18.75 μg/mL]. Except for the control group, cells in other groups were pretreated with TNF-α for 2 h, and then treated with corresponding drugs for 24 h. Caco-2 cell viability was detected by MTT; Intracellular reactive oxygen species (ROS) level were detected by flow cytometry; Total superoxide dismutase (T-SOD) activity and malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels were detected by colorimetry; qRT-PCR and Western blotting were used to detect nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), NAD(P)H quinine oxidoreductase 1 (NQO1) and heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA and protein expressions; Fluorescence microscope was used to observe nuclear penetration of Nrf2 protein.5.0—25.0 μg/mL drug-containing medium and 10—80 μg/L TNF-α had no significant effect on the viability of Caco-2 cells. Compared with TNF-α group, ROS level in Caco-2 cells of each administration group were significantly decreased (< 0.01). Except for WG group and QL group, MDA level in the other groups were significantly decreased (< 0.01), and GSH level was significantly decreased (< 0.01).gene expression was significantly increased in all drug-administered groups except WG group (< 0.01), andgene expression was significantly increased in GD group and WGC group (< 0.05, 0.01),gene expression was significantly increased in GD group and GG group (< 0.05, 0.01). Except for QL group, protein expressions of Nrf2 and HO-1 in other groups were significantly increased (< 0.01); Except for WG group and QL group, NQO1 protein expression was significantly increased in the other groups (< 0.05, 0.01), and Nrf2 protein into the nucleus was significantly increased (< 0.05, 0.01).The lack ofhas a negative effect on the inhibition of oxidative stress injury of Caco-2 cells by Gegen Qinlian Decoction.

Gegen Qinlian Decoction;; compatibility of medicines; oxidative stress; colon cancer cells

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6492 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.021

2022-07-15

上海市科技創新行動計劃自然科學基金資助項目（19ZR1451900）

林 川，男，碩士研究生，從事藥物分析與體內過程研究。Tel: 19821726781 E-mail: 3325892608@qq.com

安 叡，女，博士，教授，從事藥物分析與體內過程研究。Tel: (021)51322183 E-mail: anruimw@126.com

[責任編輯 李亞楠]