濃香白酒大曲中產普切明酸芽孢桿菌的篩選及其發酵條件優化

劉自山 ，李玲珊，李明彤，冉國清，邵小兵，劉君

1. 瀘州市南方過濾設備有限公司（瀘州 646000）；2. 四川輕化工大學生物工程學院（宜賓 644004）；3. 重慶大學生物工程學院（重慶 400044）；4. 宜賓長江源酒業有限責任公司（宜賓 644000）

我國釀酒已有幾千年的歷史，用曲釀酒是我國古代勞動人民的重大發明。傳統濃香型大曲以瀘型曲為代表。高溫大曲中的細菌多為芽孢桿菌[1-4]。芽孢桿菌在自然界中廣泛分布，與其他微生物相比，具有耐酸、耐鹽、耐高溫等優點[5-6]。芽孢桿菌所產普切明酸可通過鰲合環境中的鐵離子形成低濃度鐵離子環境，從而抑制部分微生物的生長[7-16]。研究表明，芽孢桿菌是果蔬、白酒大曲中常見的益生菌，其分泌的普切明酸可作為新型農藥和果蔬殺菌劑以取代目前實現農業和食品增產所使用的毒性物質，在釀酒等釀造食品的應用上具有較大前景[17-23]。通過白酒大曲釀造而成的中國白酒，其大曲中所含的由芽孢桿菌和酵母菌等益生合成的普切明酸及其中間產物和類似物，不僅賦予白酒潛在的抗菌功能，還能清除體內自由基，進而延緩衰老、抑制癌細胞產生及生長[24-26]。試驗以某酒廠的大曲為研究對象，篩選和鑒定產普切明酸的芽孢桿菌，通過單因素試驗和正交試驗方法分別優化芽孢桿菌發酵和生長的最佳條件，以獲得最高普切明酸產量，為促進普切明酸工業化生產提供指導，也為后續普切明酸的研究提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃香型大曲（取自川南某知名酒廠制曲生態園大曲）。

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸銨、氯化銨、檸檬酸鈉、三水合磷酸二氫鉀、七水合硫酸錳、二水合氯化鈣、六水合氯化鐵、一水合硫酸錳、瓊脂粉、蛋白胨、氯化鈉、甲醇、甘油、NaOH、濃鹽酸（均為國產分析純）。

篩選培養基：葡萄糖20 g/L、氯化銨7 g/L、檸檬酸鈉12 g/L、三水合磷酸二氫鉀0.5 g/L、七水合硫酸錳0.5 g/L、二水合氯化鈣0.15 g/L、六水合氯化鐵0.04 g/L、一水合硫酸錳0.01 g/L、瓊脂粉15 g/L。培養條件：培養溫度37 ℃、pH 7.5。

發酵培養基[27]：葡萄糖10～50 g/L、硫酸銨1～10 g/L、二水合檸檬酸三鈉1～18 g/L、三水合磷酸二氫鉀0.1～2.0 g/L、七水合硫酸錳0.1～2.0 g/L、二水合氯化鈣0.1～1.0 g/L、六水合氯化鐵0.02～0.30 g/L、二水合硫酸錳0.005～0.50 g/L、酵母粉0.1～2.0 g/L、吐溫80 0.01%～1%。培養條件：pH 7.0～7.5、培養溫度25～40 ℃、搖床轉速180 r/min、發酵時間24～40 h。

LB培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母浸出粉，10 g/L氯化鈉，pH 7.0（固體培養基則加入15 g/L瓊脂粉）。

JB-CJ-1超凈臺（常州普天儀器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（常州普天儀器制造有限公司）；TGL-23高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；FE28數顯酸度計[METTLER TOLEDO（上海）有限公司]；SPX-100B-Z恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司）；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）；Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀購（艾本德中國有限公司）；BM1000顯微鏡（安諾倫生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 產普切明酸菌株的篩選、分離與純化

大曲采樣：無菌條件下取某酒廠10 g大曲樣品放入研缽中，待樣品充分分散后在無菌條件下稱取5 g樣品加入到100 mL滅菌后的生理鹽水中（0.85%），放入搖床中振蕩混勻（37 ℃，180 r/min，30 min）。

樣品預處理：將振蕩后的菌液放入80 ℃烘箱中30 min后取出，稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7共7個濃度梯度。

菌株富集培養：取50 μL上述處理后的溶液中10-5，10-6和10-7這3個濃度梯度的溶液，加到配制好的20 mL LB培養基中置于搖床（37 ℃，180 r/min）中振蕩培養12 h。

菌株初篩：取0.1 mL菌液，在LB固體培養基與含鐵固體培養基上涂布，于37 ℃培養12 h。

菌株分離純化：取篩出的菌株，在含鐵固體培養基平板上劃線，于37 ℃培養48 h，重復3次以上，連續多次在顯微鏡下觀察到形態單一的菌體則認為菌株已純化。按照Kluyver等[28]純化步驟分離得到普切明酸。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態學鑒定

將所篩選的菌株進行菌落形態觀察、菌體形態觀察、革蘭染色。

1.2.2.2 分子生物學鑒定

篩出的菌株于50 mL LB培養基中培養（37 ℃，180 r/min，12 h），使用月桂酸鈉提取法提取DNA，并進行通用引物PCR測序后得到PCR產物，最終鑒定菌株種屬。

PCR測序步驟：試驗使用的是1492R引物，材料具體用量見表1。

表1 PCR測序材料

PCR反應按表2的操作順序加入，混勻并離心置于PCR儀上設置程序進行PCR反應。產物用1%瓊脂凝膠電泳觀察結果即可。

表2 PCR測序操作步驟

1.2.3 普切明的分離

按照Kluyver等[28]純化步驟。

1) 收集色素：收取發酵液（8 000 r/min，4 min），棄上清液，留沉淀。

2) 沉淀物用甲醇洗滌3次，用蒸餾水洗滌1次（8 000 r/min，5 min），留沉淀。

3) 沉淀物溶于2 mol/L NaOH溶液，使菌體裂解并去除不溶物。

4) 加入適量FeCl3使溶液呈黃色。

5) 用2 mol/L HCl溶液調至pH 1.0，于100 ℃加熱10 min（8 000 r/min，5 min），棄去上清液。

6) 水洗，溶于2～4 mL 2 mol/L NaOH溶液，得到黃色溶解物。

7) 在4 ℃下冷卻離心，用來去除Fe(OH)3沉淀，取上清液。

8) 用2 mol/L HCl溶液調pH至棕紅色沉淀出現，用2 mol/L HCl溶液調至pH 3～5時，離心收集沉淀。

9) 恒溫干燥20 h，得到目的產物。

1.2.4 普切明發酵的培養條件

菌株活化。挑取實驗室館藏菌株與試驗所得菌種進行LB培養基劃線培養，溫度條件為37 ℃。

種子培養。挑取上述活化后平板中的單個菌落，接種在滅好菌的液體LB培養基中，接種量為1%，在37 ℃ 180 r/min的搖床中恒溫振蕩培養12 h。

搖瓶發酵。使用條件一一對應的培養基，每瓶裝液25 mL，發酵時接種量2%，發酵時間均36 h，發酵轉速180 r/min。

1.2.5 產普切明酸培養條件優化的單因素試驗

將得到的高效產普切明酸酵母菌進行活化、擴大培養后，分別以葡萄糖添加量（34，37，40和43 g/L）、硫酸銨添加量（8.4，8.6，8.8和9.0 g/L）、pH（6.5，7.0，7.5和8.0）、接種量（1%，2%，3%和4%）、發酵溫度（25，30，35和40 ℃）和0.5 g/L不同無機鹽（氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、磷酸氫二鉀）進行單因素試驗，重復3次，其中進行單因素試驗時，其他條件固定不變。

表3 溫度、pH和葡萄糖添加量優化因素與水平

表4 葡萄糖添加量、pH、硫酸銨添加量優化因素與水平

2 結果與分析

2.1 產普切明酸菌株篩選、分離與純化結果

2.1.1 產普切明酸菌株篩選結果

產普切明酸的菌株會在含鐵培養基上顯紅色。由培養基篩選結果表明，培養基左上角部分有紅色菌落，且該細胞形態和排列呈桿狀，菌落扁平，邊緣不齊整并且呈現出紅色，表面粗糙有褶皺（圖1）。

圖1 培養基篩選結果

2.1.2 產普切明酸菌株的分離、純化結果

通過觀察培養基可以看到，圖2（A）的菌落扁平，邊緣不齊整并且顯紅色，菌落邊緣有白色，菌落有皺褶。圖2（B）是在LB培養基上進行劃線，作為空白試驗對照組圖，與圖2（A）中的為同一菌株，但不能產生紅色素。由此對照試驗可以得出，該菌株可以產紅色素，且菌落單一。

圖2 產普切明酸的地衣芽孢桿菌培養基劃線結果示意圖

將該純化后的單菌落進行生理生化試驗檢測，理化檢測結果顯示該菌為革蘭陽性菌，菌體單一，均為長桿狀。確認DNA存在后，進行通用PCR測序，確認最終種屬。經鑒定后確認試驗的目標菌株為地衣芽孢桿菌。試驗采取16S測序技術，瓊脂糖凝膠電泳圖像如圖3所示。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖像

2.2 普切明酸鑒定

普切明酸在243，282和410 nm這3個波長下有顯著波峰[31]。測定紅色粉末在190～1 100 nm范圍內的吸光度，試驗結果如圖4所示。

圖4 紅色色素粉末吸光度的變化

經過對比，樣品分別在3處地方（233，282和410 nm）產生波峰，與普切明酸的波峰吻合，可以判定該物質為普切明酸。

2.3 普切明酸發酵條件優化單因素試驗結果分析

碳水化合物的存在是誘導普切明合成的重要因素之一，選擇合適的碳源可有效提高普切明合成所需要的底物氨基酸的合成效率；通過查找文獻了解到高含量的普切明會對菌株自身的生長繁殖起到抑制作用，但是如果相應地在培養液中添加生長因子便可以有效提高細胞濃度，從而對普切明合成起到積極作用。所以試驗在發酵培養液中加入酵母粉等添加因子，以此提高普切明產量。而鐵元素作為合成普切明的底物之一，故而添加合適成分的無機鹽也是重要因素之一。所以試驗的優化發酵培養基根據芽孢桿菌的生長特點和普切明合成的特殊要求，有針對性地優化其中的關鍵組分，并通過正交試驗取得最佳成分配比，形成完整的發酵優化試驗。

2.3.1 碳源對普切明酸產量的影響

術后化療前組的納入標準：(1)術后的女性乳腺癌患者，年齡為30周歲～60周歲；(2)視聽能力正常；(3)簡易精神狀態量表總分≥24分，一般認知功能正常。術后化療前組的排除標準：(1)繼發性乳腺癌患者；(2)晚期惡病質者及除腋窩淋巴結外遠處轉移者；(3)接受過新輔助化療者；(4)曾患重大軀體疾病或腦部創傷者；(5)有酒精或藥物依賴史者；(6)患精神疾病并服用精神類藥物者。化療組的入組及排除標準同上，并要求化療后時間不超過5年。健康對照組的入組標準：身體健康，無重大軀體疾病史，無認知障礙和精神疾病史，無酒精或藥物依賴史。所有被試均簽署知情同意書志愿參加實驗。

各類碳源對普切明酸產量的影響情況見圖5。結果顯示，葡萄糖對產普切明酸產量的影響最大，可達1 125 mg/L。

圖5 碳源種類對普切明酸產量的影響

葡萄糖添加量對普切明酸含量影響如圖6所示。芽孢桿菌中一般情況下存在碳分解代謝物阻遏（CCR）效應，葡萄糖添加量應當適中，過高或過低都會影響普切明產量。隨著葡萄糖添加量增加，普切明酸產量呈先增長后逐漸趨于平穩趨勢，葡萄糖添加量40 g/L時，普切明酸產量最高。

圖6 葡萄糖添加量對普切明酸產量的影響

2.3.2 氮源對普切明酸產量的影響

以初始培養基中6.2 g/L氯化銨的含氮量作為標準，其他氮源根據含氮量調整添加量，使最終氮添加量一致，進行搖瓶發酵試驗。所篩菌株不同氮源普切明酸產量檢測結果顯示條件一致時最優氮源為硫酸銨（圖7）。

圖7 氮源種類對普切明酸產量的影響

硫酸銨添加量8.6 g/L時普切明酸含量最高。整體呈現先增長后基本穩定狀態，其優化濃度對普切明酸含量影響見圖8。

圖8 硫酸銨添加量對普切明酸產量的影響

2.3.3 pH對普切明酸產量的影響

隨著pH的升高，普切明酸產量呈現先升后下降趨勢，pH 7.5時，普切明酸產量最高，為960 mg/L。原因是隨著酸性過渡到堿性，普切明酸溶于堿性溶液中，使得產量有些許降低，pH對普切明酸產量的具體影響參見圖9。

圖9 pH對普切明酸產量的影響

2.3.4 接種量對普切明酸產量的影響

接種量在2%時普切明酸含量即能達到980 mg/mL以上，并達到峰值，再增加菌株接種量，其普切明酸產量的變化不再明顯（圖10）。

圖10 接種量對普切明酸產量的影響

2.3.5 發酵溫度對普切明酸產量的影響

隨著發酵溫度的升高，普切明酸產量呈現先升后降趨勢，發酵溫度37 ℃時普切明酸含量達到最高。可能是溫度過高時，普切明酸被分解，菌株胞內的累積量自然有些許降低，不利于產普切明酸。發酵溫度對普切明酸的具體影響情況參見圖11。

圖11 發酵溫度對普切明酸產量的影響

2.3.6 無機鹽種類對普切明酸產量的影響

無機鹽對所篩選菌株產普切明酸的影響不大，除磷酸氫二鉀相對其他無機鹽有一定影響外，其他無機鹽的普切明酸產量均達到1 000 mg/L（圖12）。

圖12 無機鹽種類對普切明酸普切明酸產量的影響

2.4 培養基優化正交試驗

經單因素試驗以及正交試驗結果表明在其他條件相同的情況下，溫度、pH和葡萄糖添加量對普切明酸產量影響較大。結合芽孢桿菌的生長特性和發酵特性，設計9個小組試驗比較普切明酸發酵產量，測定結果中發現普切明酸產量最高的是第9組。從普切明酸相對產量的極差分析可得，在正交試驗設計條件下，各因素影響普切明酸產量的主次順序：pH＞溫度＞葡萄糖添加量。由均值分析得到普切明酸的最優培養基組合A3B3C2，即溫度40 ℃、pH 7.5、葡萄糖添加量40 g/L。普切明酸的產量達到1 236 mg/L。

表5 試驗設計及極差分析結果

3 結論

從川南知名酒廠大曲中篩選得到一株產普切明酸的菌株，經鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌。碳源、氮源、pH、接種量、發酵溫度、無機鹽等單因素對該地衣芽孢桿菌菌株產普切明酸產量均有不同程度的影響。采用單菌株單因素試驗與正交試驗相結合的試驗方案，優化目的菌株發酵條件產普切明酸，綜合試驗結果表明，溫度、pH、葡萄糖對發酵的影響最為顯著，當溫度40 ℃、pH 7.5、葡萄糖添加量40 g/L時，普切明酸的產量達到1 236 mg/L。