響應面法優化圣女果水開菲爾發酵工藝

董鑫鑫，舒國偉，代春吉，萬紅昌，董旭，陳合

1. 陜西科技大學 食品與生物工程學院（西安 710021）；2. 陜西雅泰乳業有限公司（咸陽 713701）

水開菲爾粒是由乳桿菌為主，包括醋酸菌和酵母菌在內的多種細菌和真菌共同構成的共生菌系之間通過某些細菌分泌的多糖結合在一起形成的顆粒[1-2]。關于其起源最流行的理論是水開菲爾粒是由墨西哥仙人掌的汁液發酵而成的顆粒[3]。Gulitz等[4]對德國不同地區的樣本進行研究，結果顯示乳酸菌科的細菌數量最多。乳酸菌在無氧條件下發酵[5]，醋酸菌、酵母菌可以在果蔬表面形成薄膜，為乳酸菌提供厭氧環境，有利于乳酸菌的生長[6]。水開菲爾粒在室溫下持續發酵1或2 d，可以得到混濁的淺黃色飲料[7]，呈輕碳酸和酸性[7-8]。由水開菲爾粒發酵糖水、水果汁等得到的飲品被稱為水開菲爾。世界上許多地區都有用水開菲爾粒制作飲料的習慣[9]。在南美洲流行一種叫作“Tepache”的飲料，該飲料通過將肉桂、菠蘿和紅糖與水開菲爾粒一起發酵制成[10]。Randazzo等[9]使用地中海水果如蘋果、葡萄、石榴和蔬菜如胡蘿卜、番茄、洋蔥等加入混合發酵劑成功生產了所謂的“水開菲爾飲料”。這些飲料在發酵過程中會產生大量益生菌[11]、多糖、有機酸，具有抑制病原微生物[12]、抗炎[13]、提高免疫力[14]等功效。自然發酵的水開菲爾具有改善人體胃腸道蠕動、增強身體免疫力的作用，在全球范圍廣泛飲用[15]，在歐美國家更為盛行，在我國研究較少，針對水開菲爾粒研究多限于乳制品[16]。當前市場上大多數發酵果蔬汁產品選用的發酵菌種單一、果蔬原料單調[17]，一定程度上限制了產品的種類和風味[18]。

研究對水開菲爾粒發酵圣女果汁進行優化，研究接種量、發酵溫度、發酵時間對水開菲爾粒發酵的影響，基于單因素試驗結果，采用Box-Behnken試驗分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗模型分析，設計三因素四水平試驗，考察各因素之間的交互作用，確定水開菲爾粒發酵圣女果汁的最佳工藝條件，并對最佳工藝條件進行預測及驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圣女果，購于陜西省西安市陜西科技大學超市；4種水開菲爾粒，由陜西科技大學食品與生物工程學院1C-419實驗室保存，分別購于湖南永州、廣東深圳、遼寧沈陽、山東濟寧，編號分別為HY、GS、LS、SJ。

氫氧化鈉（分析純，天津市紅巖化學試劑廠）；酚酞（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；鹽酸（分析純，鄭州派尼化學試劑廠）；紅糖（食品級，南京甘汁園糖業有限公司）；番紅花T（天津市河東區紅巖試劑廠）。

1.2 儀器與設備

DH5000AB電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BCD-201E/A電冰箱（海信科龍電器股份有限公司）；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化儀器有限公司）；LE204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；EX20電子顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；DT34618移液槍[大龍興創實驗儀器（北京）有限公司]；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（上海科恒實驗儀器有限公司）；JS51D-250榨汁機（廣東美的電器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 水開菲爾粒活化與篩選

活化：配制10%的紅糖水，加熱煮沸至完全溶解，分裝于500 mL玻璃瓶中，冷卻至室溫后，按6%的接種量分別接種4種水開菲爾粒，室溫下培養24 h。

篩選：配制10%的紅糖水，分裝于500 mL的玻璃罐中，將HY、GS、LS、SJ此4種水開菲爾粒分別以6%的接種量置于紅糖水中發酵24 h，分別在發酵的第12，第15，第18，第21和第24小時檢測樣液的pH和酸度，在第24小時對發酵后的水開菲爾粒進行稱重，從而篩選出產酸快且增重多的水開菲爾粒。

1.3.2 pH測定及濕重測定

在室溫條件下，使用PHS-3C pH計直接測定，每個樣品測定平行數據3次。

1.3.3 濕重測定

用電子天平上測量發酵前后水開菲爾粒的濕重。

1.3.4 酸度測定

按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》[19]中規定的方法測定發酵圣女果汁飲料的酸度。

1.3.5 發酵圣女果汁感官評定

發酵圣女果汁感官評定細則見表1。

表1 感官評定細則

1.3.6 響應面優化試驗

以發酵圣女果汁pH、酸度和水開菲爾粒增重為指標，采用單因素試驗研究發酵溫度、發酵時間以及水開菲爾粒接種量對水開菲爾粒發酵圣女果汁的影響。在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken中心組合設計原則，以發酵溫度、發酵時間以及水開菲爾粒接種量為自變量，以發酵圣女果汁的pH、酸度、增重百分比、風味為響應值，利用Design-Expert. V.8.0.6軟件進行試驗模型分析，設計三因素四水平的試驗，考察各因素之間的交互作用，確定水開菲爾粒發酵圣女果汁的最佳工藝條件，并對最佳發酵工藝條件進行預測及驗證。試驗因素水平見表2。

表2 響應面試驗因素和水平

2 結果與分析

2.1 水開菲爾粒篩選試驗結果

在27 ℃下，用接種量為6%的水開菲爾粒發酵濃度為10%的紅糖水，分別在培養的第12，第15，第18，第21和第24小時測定發酵液的pH及酸度，在第24小時測定水開菲爾粒濕重。不同水開菲爾粒對紅糖水發酵的影響見表3。

由表3可知：發酵12 h時，發酵液pH范圍為4.0～4.2；發酵24 h時，4種水開菲爾的pH均低于4，其中水開菲爾粒GS發酵的紅糖液pH最低（pH 3.83）；發酵24 h時，水開菲爾粒GS與LS發酵的紅糖液酸度最高（9.30 g/L），且水開菲爾粒GS增殖能力更強。綜合考慮水開菲爾粒風味，篩選出水開菲爾粒GS進行下一步的發酵試驗。

表3 水開菲爾粒發酵紅糖水試驗結果

2.2 Box-behnken試驗設計優化水開菲爾粒發酵圣女果汁及結果分析

單因素試驗結果顯示：當發酵溫度為33 ℃時，發酵圣女果汁可達最大酸度；水開菲爾粒增重比隨著接種量的增大持續降低，當接種量為4%時，發酵圣女果汁達最小pH 3.84，達最大酸度17.73 g/L；在發酵的

12～24 h，pH下降的速率最大且可達到最大增重速率。

在單因素試驗基礎上，以發酵圣女果汁pH、酸度、水開菲爾粒增重比和感官評定為指標，采用Box-Benhnken法進行試驗設計，確定水開菲爾粒發酵圣女果汁最佳工藝參數，試驗設計及結果見表4。

表4 水開菲爾粒發酵圣女果汁試驗設計及結果

根據表4的試驗結果，利用Design-Expert. V8.0.6軟件進行數據分析，得到回歸方程：

式中：A為溫度，℃；B為接種量，%；C為發酵時間，h。對所得pH、酸度、增重百分比、感官評價的二次回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，結果分別見表5和表6。

表6 水開菲爾粒增重比及圣女果水開菲爾感官評價的方差分析

水開菲爾粒GS發酵圣女果汁培養條件的優化數學模型顯示了發酵溫度、接種量、發酵時間對發酵圣女果汁pH和酸度的交互作用。由表5可知，當以pH作為響應值時，回歸方程模型的P值（P＜0.000 1）極顯著，決定系數R2為98.38%，說明該二次方程可以在超過98.38%的情況下使用，調整系數（Radj2）為96.29%，說明實際測量值與預測值有很好的聯系，證明對pH的預測可行。接種量和發酵時間的二次主效應顯著（PB2＜0.05，PC2＜0.001），這表明水開菲爾粒發酵圣女果汁中的變量和pH之間不是簡單的線性關系，各因素顯著順序為發酵時間（C）＞接種量（B）＞溫度（A）。

表5 圣女果水開菲爾pH、酸度的方差分析

以酸度作為響應值時，回歸模型方程的P值極其顯著（P＜0.000 1），表明回歸模型具有極大的意義。決定系數R2為99.46%，表明該二次方程可應用于超過99.46%的實際情況。接種量和發酵時間的二次效應明顯（PB2＜0.05，PC2＜0.000 1）。同時，發酵時間（C）對培養液的酸度有極其顯著的影響（P＜0.001），這表明水開菲爾粒GS發酵圣女果汁的變量與酸度之間不是簡單的線性相關關系，各因素顯著順序為發酵時間（C）＞接種量（B）＞發酵溫度（A）。

根據表6方差分析結果可以看出，當以水開菲爾粒增重比作為響應值時，回歸方程模型項P值小于0.000 1，表明該模型極其顯著，且水開菲爾粒的接種量對其影響最顯著。接種量（B）對水開菲爾粒增重的影響極其顯著（P＜0.000 1）。當以發酵圣女果汁感官評定作為響應值時，回歸方程模型項P值小于0.01，表明該模型非常顯著。接種量（B）和發酵時間（C）對發酵圣女果汁感官評定的影響非常顯著（PB＜0.01，PC＜0.01）。均無二次項，表明各試驗因素對此二個響應值的影響是簡單的線性關系。

發酵溫度、水開菲爾粒接種量、發酵時間對發酵圣女果汁的pH和酸度有交互影響，對此三種條件進行響應面分析，探究它們之間的具體交互規律。采用二維等高線圖和三維響應面圖對三個自變量之間的相互作用進行直觀的解釋，對回歸模型獲得的響應面圖和等高線圖見圖1～圖6。

三維響應面圖和二維等高線圖可以直觀地解釋兩個自變量之間的相互作用。三維響應面圖可以指示自變量對響應變量的影響，二維等高線圖可以解釋自變量之間相互作用的顯著性。在響應面圖中，對水開菲爾粒發酵圣女果汁影響越大的因素，其曲線變化趨勢越大。在等高線圖中，軸向等高線越密集，說明該因素對發酵圣女果汁的影響越顯著。由圖1～圖6可知，pH和酸度這兩個響應因素在相應的試驗范圍內存在響應極值，且3組因素的交互作用結果與方差分析結果一致。溫度和接種量酸度影響的等高線圖類似橢圓形，表明溫度和接種量對酸度的交互作用較強。溫度和接種量對pH影響的等高線圖接近正圓形，表明此兩種因素對pH的影響不顯著；接種量和發酵時間對pH、酸度影響的3D圖接近馬鞍形，表明此兩個因素對結果的影響不顯著，與方差分析結果相同。

圖1 溫度和接種量對pH影響的響應面及等高線

圖2 溫度和發酵時間對pH影響的響應面及等高線

圖3 接種量和發酵時間對pH影響的響應面及等高線

圖4 溫度和接種量對酸度影響的響應面及等高線

圖6 接種量和發酵時間對酸度影響的響應面及等高線

圖5 溫度和發酵時間對酸度影響的響應面及等高線

2.3 最佳工藝條件試驗驗證

通過響應面試驗結果分析及等高線圖分析，水開菲爾粒發酵圣女果汁的最佳工藝條件為發酵溫度31℃、接種量4.47%、發酵時間17.89 h，在此條件下預測發酵圣女果汁pH為3.7，酸度為19.36 g/L，增重比為0.21，感官評價為73分。考慮到實際可操作性，將發酵條件修正為發酵溫度31 ℃、接種量4.5%、發酵時間18 h，在此條件下進行平行試驗。經過3組平行試驗，最終pH為3.75，酸度為18.40 g/L，增重比為0.20，感官評價為78分。與模型預測值接近，驗證了試驗結果的可靠性。

2.4 討論

試驗使用水開菲爾粒作為發酵劑，以圣女果汁作為發酵基質，探究其發酵的最佳工藝條件。圣女果營養豐富[20]，含有硒等多種微量防癌抗癌的物質[21]，研究表明，經常食用西紅柿制品可預防和治療多種癌癥和疾病，可抗日曬和延緩衰老，且無副作用[22]。目前已有科研人員使用多種發酵劑對圣女果深加工進行研究。侯瀟[20]研制出多菌種發酵圣女果柑桔復合汁飲料，最佳發酵溫度為30和40 ℃（分段發酵），這與試驗結果接近。侯瀟[23]研制的多菌種發酵冬棗圣女果飲料的最佳發酵時間為32 h，與試驗結果差異較大，可能是由于發酵菌種及發酵基質的不同導致。張開平等[24]用5%的菌種接種量發酵芒果汁與圣女果汁，制得風味良好、口感宜人的乳酸菌發酵飲料。與普通發酵菌種相比，水開菲爾粒菌系復雜，其發酵過程中可以產生多種多樣的酶，對底物的水解作用更強，不僅能夠水解多糖類成分，也可以水解以糖苷形式存在的風味前體成分，釋放出誘人的果香，菌系自身也會產生復雜、協調的香氣成分，并產生各種具有保健功效的次級代謝產物，保健作用更強[25]。水開菲爾在俄羅斯、美國和東歐的銷量非常高，但在我國相關報道較少。圣女果水開菲爾前景廣闊，作為發酵劑的水開菲爾粒也值得深入探究。

3 結論

接種量和發酵時間對發酵圣女果汁的pH、酸度和感官評定有顯著影響，接種量對水開菲爾粒增重比有極顯著影響。優化得到發酵圣女果汁的最佳條件：發酵溫度31 ℃、接種量4.5%、發酵時間18 h，在此條件下得到的圣女果水開菲爾理化性質良好。驗證結果與預測值無顯著性差異，建立的回歸方程擬合良好，采用響應面法優化水開菲爾粒發酵圣女果汁工藝參數可行。該研究可為功能性圣女果汁發酵飲料的開發提供參考，為圣女果汁綜合深加工提供借鑒。