花椒及花椒制品中羥基-α-山椒素檢測方法

馬偉，鐘慈平，何成軍，溫泉，杜鋼

四川省食品檢驗研究院（成都 611731）

花椒為蕓香科植物青椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc）或花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim）除去種子和雜質后的干燥成熟果皮。性辛，溫。歸脾、胃、腎經。溫中止痛，殺蟲止癢。用于脘腹冷痛，嘔吐泄瀉，蟲積腹痛；外治濕疹[1]。花椒在我國的應用已有兩千余年的歷史，其廣泛用于調味料、香料及中藥，被譽為我國傳統的“八大調味品”之一[2-3]。花椒在全世界有250多種，亞洲是花椒主產區，中國約有45種，13個變種[4]。花椒在我國栽培歷史悠久，范圍廣產量大，主要分布在陜西、四川、甘肅、云南等地，總產量居世界第一[5]。四川作為花椒的主要產區之一，研究開發、轉化推廣一批新品種、新技術、新產品、新模式，支撐引領全省花椒產業的創新發展[5]。

花椒的化學成分較復雜，包括生物堿、揮發油、脂肪酸、香豆素、酰胺、黃酮苷、甾醇和三萜類等，花椒中富含的揮發油是香氣的主要來源[7]，酰胺類物質是花椒呈麻味的主要成分，大多為鏈狀不飽和脂肪酰胺類物質，其中以羥基-山椒素為代表，具有強烈的刺激性，是衡量花椒品質的重要指標之一[8-9]。關于麻味物質，相關研究從花椒果皮中分離出超過25種花椒麻素[10-13]。較多的有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素和羥基-ε-山椒素等，其中以花椒中羥基-α-山椒素含量為最高[14-16]。羥基-α-山椒素首次由Yasuda等[17]從日本花椒中分離，是花椒果皮中最早分離出來的花椒麻素和食物中最主要誘發獨特刺痛感（麻味）的化合物。

隨著國內花椒產業的迅猛發展，針對花椒品質的等級分類沒有形成統一量化的標準，嚴重制約了整個產業健康、高質的發展，而針對麻味物質作為衡量花椒品質的重要指標，至今未出臺相關的檢測標準。試驗通過對花椒中麻味物質含量最高、最主要誘發麻味的羥基-α-山椒素檢測方法進行研究，旨在為后期花椒麻素相關標準的制定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒、花椒粉、花椒油、花椒提取物（產地：四川）；羥基-α-山椒素（純度98.0%，成都普思生物科技股份有限公司）；甲醇、無水乙醇、乙腈、乙酸乙酯（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計（EVOLUTION 201，Thermo）；電子天平（ME203，METTLER TOLEDO）；渦旋儀（Multi Reax，Heidolph）；超聲儀（IDH30，IRM）；離心機（ROTANTA 460R，Hettich）。

1.3 方法

1.3.1 標準品的配制

羥基-α-山椒素儲備液：準確稱取29.71 mg羥基-α-山椒素于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得羥基-α-山椒素儲備液（質量濃度5.823 2 mg/mL，有效期3個月）。

羥基-α-山椒素：準確吸取100 μL上述儲備溶液置5 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，即得羥基-α-山椒素標準工作液（質量濃度116.464 μg/mL，有效期1個月）。

1.3.2 標準曲線的繪制

分別準確吸取0.05，0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mL上述標準工作液，置于10 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，羥基-α-山椒素系列標準溶液質量濃度（臨用現配）分別為0.582 3，1.164 6，2.329 3，3.493 9，4.658 6和5.823 2 μg/mL，用分光光度計在268 nm處，以試劑空白為參比，在1 cm比色皿測定吸光度，以羥基-α-山椒素的量（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 供試樣制備方法

1.3.3.1 提取試劑選擇

分別準確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，分別準確加入50 mL甲醇、乙腈、無水乙醇、乙酸乙酯、水，超聲提取15 min，放冷后取適量提取液于4 500 r/min離心5 min。準確吸取0.1 mL花椒和花椒粉提取液、0.5 mL花椒油提取液、0.025 mL花椒提取物提取液分別置于25 mL容量瓶中，加相應提取試劑定容至刻度，搖勻，即得待測溶液。

1.3.3.2 提取試劑體積選擇

分別準確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，分別準確加入10，25，50和100 mL無水乙醇，超聲提取15 min，放冷后取適量提取液以4 500 r/min離心5 min。分別準確吸取0.02，0.05，0.10和0.20 mL花椒和花椒粉提取液，0.10，0.25，0.50和1.00 mL花椒油提取液，0.02，0.05，0.10和0.20 mL花椒提取物提取液，分別置于25mL（花椒、花椒粉、花椒油提取液）和100 mL（花椒提取物提取液）容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得待測溶液。

1.3.3.3 提取時間選擇

分別準確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，各準確加入50 mL無水乙醇，分別超聲提取5，10，15，30和60 min，放冷后取適量提取液以4 500 r/min離心5 min。分別準確吸取0.1 mL花椒和花椒粉提取液、0.5 mL花椒油提取液、0.025 mL花椒提取物提取液各置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得待測溶液。

1.3.3.4 提取方式選擇

分別準確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，各準確加入50 mL無水乙醇，分別超聲提取15 min、渦旋提取15 min、常溫浸提24 h，放冷后取適量提取液以4 500 r/min離心5 min。分別準確吸取0.1 mL花椒和花椒粉提取液、0.5 mL花椒油提取液、0.025 mL花椒提取物提取液各置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得待測溶液。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

配制適當濃度羥基-α-山椒素對照品，與處理后樣品分別放入紫外-分光光度計中進行全波長掃描，掃描結果見圖1～圖2。結果發現其最大吸收峰都為268±1 nm，所以選擇268 nm為測定波長。

圖1 羥基-α-山椒素對照品掃描圖譜

圖2 花椒樣品掃描圖譜

2.2 提取試劑的選擇

甲醇、乙腈、無水乙醇、乙酸乙酯、水5種試劑提取羥基-α-山椒素結果見圖3。結果發現提取試劑甲醇、乙腈、乙酸乙酯和無水乙醇在4品類樣品花椒、花椒油、花椒粉、花椒提取物中提取率無顯著性差異，水提取率最低，考慮成本及安全性，建議采用無水乙醇為提取試劑。

圖3 5種提取試劑提取羥基-α-山椒素結果

2.3 提取體積的選擇

不同提取試劑體積提取羥基-α-山椒素結果見圖4～圖7。結果發現提取溶劑分別為10，25，50和100 mL時，提取溶劑量對提取率無明顯差異，100 mL提取率基本達到最大。由于花椒制品品類較多，為保證麻味物質能完全提取，建議提取試劑100 mL。

圖4 從花椒中用不同無水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結果

圖5 從花椒油中用不同無水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結果

圖6 從花椒粉中用不同無水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結果

圖7 從花椒提取物中用不同無水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結果

2.4 提取時間的選擇

圖9 從花椒油中用不同提取時間提取羥基-α-山椒素結果

圖10 從花椒粉中用不同提取時間提取羥基-α-山椒素結果

不同提取時間羥基-α-山椒素結果見圖8～圖11。結果發現提取時間分別為5，10，15，30和60 min時，花椒、花椒油、花椒粉、花椒提取物提取率均無明顯差異，15 min提取率基本達到最大。從提取率及檢測效率考慮，建議提取時間15 min。

圖8 從花椒中用不同提取時間提取羥基-α-山椒素結果

圖11 從花椒提取物中用不同提取時間提取羥基-α-山椒素結果

2.5 提取方式的選擇

不同方式提取羥基-α-山椒素結果見圖12。結果發現提取方式分別為超聲提取、渦旋提取、浸泡提取時，花椒、花椒油、花椒粉、花椒提取物提取率基本相同，從檢測方便性及檢測效率出發考慮，建議采用超聲的提取方式。

圖12 3種提取方式提取羥基-α-山椒素結果

2.6 標準曲線方程

配制0.582 3～5.823 2 μg/mL質量濃度的標準系列溶液（現用現配），用分光光度計在268 nm處，以試劑空白為參比，測定吸光度，以羥基-α-山椒素的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖13所示。結果表明在現有濃度范圍內線性回歸方程為Y=0.165 9X-0.001，r=0.999 9，線性良好。

圖13 羥基-α-山椒素標準曲線

2.7 回收率考察

采用優化后的條件進行方法回收率考察。由于樣品的稀釋倍數較大，采取增大稱樣量即測得已知樣品含量后加入樣品的加標方式考察該方法的可行性，結果見表1。結果表明平均回收率在96.8%～97.8%，SRSD＜4%。

2.8 方法精密度考察

準確取花椒、花椒粉、花椒油、花椒提取物各0.3 g，各6份，置于錐形瓶中，按照優化好的方法條件進行提取和稀釋，供紫外分光光度計測定，計算方法精密度，結果見表2。結果表明SRSD＜3%，方法精密度良好。

2.9 方法穩定性考察

取質量濃度為2.3 μg/mL的對照品溶液和質量濃度約為2.2 μg/mL的樣品溶液，分別于0，2，4，18，20和24 h在紫外分光光度計268 nm處測定吸光度，結果見表3。結果表明，對照品溶液和樣品溶液在24 h內穩定。

表3 對照品溶液和樣品溶液紫外穩定性結果

2.10 不同產地花椒中羥基-α-山椒素成分分析

通過表4數據比對可以得出四川、甘肅和陜西3地紅花椒中羥基-α-山椒素含量以四川最高101.22 mg/g，陜西最低57.76 mg/g，竹葉花椒中羥基-α-山椒素含量相比較于3地紅花椒和青花椒含量最低，為46.88 mg/g。

表4 不同產地花椒樣品中羥基-α-山椒素含量比對

3 結論

通過對花椒及花椒制品中羥基-α-山椒素檢測方法進行研究，通過全波長掃描確定該方法的檢測波長為268 nm，最終確定該方法供試品的制備以乙醇為提取試劑，提取溶劑體積100 mL，提取時間15 min，提取方式采用超聲，該方法得出在質量濃度范圍0.582 3～5.823 2 μg/mL時線性回歸方程Y=0.165 9X-0.001，r=0.999 9，線性良好，方法精密度良好，SRSD＜3%，平均加標回收率在96.8%～97.8%之間，該方法對照品溶液和樣品溶液在24 h內檢測穩定性良好，SRSD＜3%。該方法通過對關鍵參數的研究，提供一種簡便、快速、準確測定花椒及花椒制品中羥基-α-山椒素的檢測方法，為后期麻味物質檢測相關標準的出臺提供參考依據。該方法可對全國范圍內的花椒及其制品中羥基-α-山椒素的含量進行研究，以考察全國不同產區、品種花椒麻味物質含量分布，為花椒產業的發展奠定良性基礎。