植物乳桿菌真空冷凍干燥工藝的優化

宮俊峰，張國柱，趙玉明，彭曉光，麻杰，王慕華

1. 山西維爾生物乳制品有限公司（太原 030006）；2. 山西省生物研究院有限公司醫藥生物技術山西省重點實驗室（太原 030006）

植物乳桿菌存在于人類腸道中，起重要的生理作用，是目前開發研究較為深入的一種常見益生菌[1-2]，具有提高免疫[3]、改善人體腸道菌群平衡[4]、抑制病原體的繁殖[5]及抗癌[6]等功能，被廣泛應用于食品、藥品及保健品等領域[7]。降低溫度、水分、壓力、含氧量等不利條件的影響，提高菌體存活率，一直是產品開發及應用過程中急需解決的問題[8]。目前，通常采用的制備菌粉的方法有氣流干燥法、冷凍干燥法和噴霧干燥法[9]。真空冷凍干燥法[10]通過快速凍結需要干燥的物料，在較低的溫度下升華水分，達到干燥目的[11-12]，被認為是最為溫和的脫水技術，被廣泛應用于各類益生菌菌粉的制備。但受各種因素影響，在凍干過程中細胞仍然會受到各種損害，降低細胞存活率，甚至引起菌體死亡。凍干保護劑可以改善菌體凍干時的環境[13-15]，合適的凍干條件可以減少冷凍干燥過程中對細胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性[16-17]，研究采用真空冷凍干燥方法制備植物乳桿菌菌粉，通過對凍干保護劑配方的優化和凍干條件的研究，考察不同工藝對菌體存活率的影響，從而獲得較好的植物乳桿菌真空冷凍干燥工藝，以期為凍干益生菌的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：植物乳桿菌SX68，山西省生物研究院有限公司分離、保藏。

平板活菌計數培養基：MRS培養基。

種子培養基：MRS肉湯[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

發酵培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO43 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖30 g/L，吐溫80 1 mL/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.4，試劑均為進口或國產分析純。

1.2 儀器與設備

BJ-2CD超凈工作臺（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；SPX-150B-Z生化培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；FE28-standard pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；MTV-1漩渦振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；H1850R冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；Minispin plus高速離心機（德國艾本德股份公司）；DK-8D電熱恒溫水浴槽（常州諾基儀器有限公司）；UV-1500紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司）；C-32厭氧培養盒（日本三菱瓦斯化學株式會社）。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌高密度培養

植物乳桿菌經斜面活化后，接種于10 L種子罐，于35 ℃培養16 h，按接種量20 mL/L接種于100 L發酵罐中。培養條件：起始pH 6.5，培養溫度35 ℃，溶氧控制在100 mL/L以下，攪拌轉速50 r/min，罐壓0.03 MPa，發酵培養20 h。

1.3.2 植物乳桿菌發酵液濃縮

發酵結束后，將發酵液通過運輸管道打入管式離心機中，按10 000 r/min連續離心20 min制備菌泥。

1.3.3 凍干保護劑配方優化

在100 mL無菌水中添加2.5 g脯氨酸、3 g水溶性海藻糖的基礎上，選取對凍干后菌株存活率影響較大的保護劑脫脂乳粉、低聚果糖、乳糖和半乳糖作為不同因素設計正交試驗，確定最佳凍干保護劑配方。

1.3.4 凍干條件優化

在確定最佳凍干保護劑的基礎上，以預凍溫度、預凍時間、菌泥比例、凍干鋪平厚度作為不同因素設計正交試驗，優化凍干條件。

1.3.5 植物乳桿菌凍干粉制備

在最優凍干保護劑配方、最佳凍干條件下，真空度保持0.2 mbar，做凍干曲線，制備益生菌凍干粉。

2 結果與討論

2.1 植物乳桿菌高密度培養

100 L發酵罐在裝液量70 L的情況下，嚴格控制發酵條件，發酵20 h，發酵液稀釋20倍，以正常發酵5罐計，菌體平均A600可達0.46，平板活菌計數平均活菌量可達8.32×1010CFU/mL。

2.2 植物乳桿菌菌泥制備

發酵結束后，菌液經管式離心機以10 000 r/min連續離心20 min制備菌泥，70 L發酵液最終離心可得菌泥700 g。平板活菌計數活菌量可達9.18×1011CFU/g，菌體存活率為11.03%。

2.3 凍干保護劑配方優化

不同類型的保護劑保護機制不同，單一類型的凍干保護劑往往不能達到很好的保護效果，因此需要將多種類型的保護劑進行復配從而得到復合凍干保護劑，從多個方面對菌株進行保護。較常使用的保護劑有糖類（海藻糖、乳糖、半乳糖、低聚果糖等）、氨基酸類（脯氨酸、丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸等）和復合物（脫脂乳粉、明膠），它們以不同的方式保護菌體免遭外界侵害。在前期工作的基礎上，50 g菌泥加100 mL無菌水，固定脯氨酸、水溶性海藻糖的添加量，將為細胞提供機械保護和阻止冰晶生長的半滲透類保護劑低聚果糖、乳糖、半乳糖，和可以在細菌壁外表面形成保護殼、阻止細胞與冰晶和氧氣接觸從而減少菌株損傷的不滲透類保護劑脫脂乳粉作為不同因素設計正交試驗，確定最佳凍干保護劑配方。正交試驗設計及結果如表1所示。

表1 凍干保護劑配方正交試驗

從表1可見：不同因素對凍干后菌體密度影響大小依次為低聚果糖＞脫脂乳粉＞半乳糖＞乳糖，其最佳添加量為100 mL無菌水中低聚果糖5 g，脫脂乳粉12.5 g，半乳糖4.5 g，乳糖3 g。最佳保護劑配方為低聚果糖5 g/100 mL、脫脂乳粉12.5 g/100 mL、半乳糖4.5g/100 mL、乳糖3 g/100 mL、脯氨酸2.5 g/100 mL、水溶性海藻糖3 g/100 mL。用此保護劑制備菌粉，平板活菌計數活菌量可達4.67×1011CFU/g。凍干前菌泥的質量為700 g，活菌量為9.18×1011CFU/g；凍干后菌粉質量為1 127 g，活菌量為4.67×1011CFU/g；菌體存活率為81.90%。

2.4 凍干條件優化

預凍溫度和預凍時間對菌體的冷凍干燥非常重要，若預凍溫度較高、時間過短，樣品無法完全冷凍，真空升華過程中融化并且膨脹發泡，影響最終的菌粉狀態；若預凍溫度過低、預凍時間過長，不僅會增加能耗，浪費資源，而且會加重菌體損傷，降低菌株的凍干存活率。凍干時菌體和凍干保護劑在凍干盤中的厚度直接影響凍干時間。因此，在確定最佳凍干保護劑的基礎上，以預凍溫度、預凍時間、菌泥與水的比例、凍干鋪平厚度作為不同因素設計正交試驗，優化凍干條件。正交試驗設計及結果如表2所示。

表2 凍干條件正交試驗

從表2可見：不同凍干條件對凍干粉活菌數影響大小依次為菌泥比例＞預凍溫度＞預凍時間＞凍干厚度，其最佳凍干條件為菌泥比例50 g/100 mL，預凍溫度-45 ℃，預凍時間4 h，凍干厚度1.0 cm。確定最優凍干條件：菌泥比例50 g/100 mL、預凍溫度-45 ℃、預凍時間4 h、凍干厚度1.0 cm、真空度0.2 mbar。在此條件下，平板活菌計數活菌量可達5.06×1011CFU/g，菌體存活率為88.74%。

2.5 植物乳桿菌菌粉制備

在最優凍干保護劑配方、最佳凍干條件下，真空度保持0.2 mbar，做凍干曲線，制備益生菌凍干粉。益生菌凍干粉制備曲線如圖1所示。

圖1 益生菌粉凍干曲線

從圖1可見：-45 ℃預凍4 h后，開始凍干粉制備。起始溫度-35 ℃，2 h后升溫至-25 ℃，5 h后升溫至-20 ℃，然后-20，-15，-10，-5和0 ℃各保持10 h，升溫至25 ℃、2 h，最終升溫至35 ℃、6 h結束真空冷凍干燥。在此條件下，凍干總時長69 h，凍干粉活菌數均可達到5×1011CFU/g以上。

3 結論

目前所見的關于真空冷凍干燥技術的報道大多集中在凍干保護劑的優化上，關于凍干條件的優化很少見。研究通過正交試驗，最終優化后的植物乳桿菌凍干保護劑為低聚果糖5 g/100 mL、脫脂乳粉12.5 g/100 mL、半乳糖4.5 g/100 mL、乳糖3 g/100 mL、脯氨酸2.5 g/100 mL、水溶性海藻糖3 g/100 mL；最優凍干條件為菌泥比例50 g/100 mL、預凍溫度-45 ℃、預凍時間4 h、凍干厚度1.0 cm、真空度0.2 mbar。在此條件下，植物乳桿菌的凍干存活率為88.74%，優化凍干條件后植物乳桿菌存活率提高了6.84%，植物乳桿菌凍干存活率較現有報道都高[18]。該試驗建立了植物乳桿菌凍干粉的制備工藝，可為益生菌凍干粉的進一步開發利用提供參考。