牛大力總酚酸提取工藝優化、定量分析及抗氧化活性研究

石敏，吳桂妮，藍淼杏

廣西農業職業技術大學食品工程系（南寧 530007）

牛大力為豆科崖豆藤屬植物，富含黃酮類、生物堿、多糖、酚酸類、甾醇類等活性成分，營養價值和藥用價值極高[1-4]。據報道，牛大力具有養腎補虛、強筋活絡、平肝和潤肺之功效[5-6]。南方地區常用牛大力熬湯、制酒，味道甘香甜口、口味極佳。近年來，隨著人們保健意識和食療意識的提高，牛大力及其深加工產品深受人們的喜愛[7-9]。

酚酸類化合物廣泛分布于中草藥中，其在抗菌消炎、抗氧化、抗癌、降血糖血脂和治療心血管疾病等方面具有一定的藥理作用[10-14]。酚酸含量的測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、質譜法和毛細管電泳法[15-19]。其中，色譜法前處理步驟繁瑣，質譜法耗費高，毛細管電泳法重現性差。相對而言，分光光度法操作簡單、準確快速。關于牛大力中酚酸類化合物的研究僅局限于物質的提取分離鑒定。

試驗采用超聲波輔助提取法對牛大力總酚酸進行提取，通過正交試驗優化，得到最優酚酸提取工藝；采用分光光度法，通過單因素試驗優化，得到最優酚酸測定條件，并對該方法學進行考察；通過自由基清除試驗考察牛大力酚酸的抗氧化能力。試驗以期為牛大力深加工、質量控制和價值開發提供借鑒，以推動現代保健食品深加工產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛大力采自廣西南寧、欽州、北海、玉林、百色、柳州等多地，經廣西藥用植物園彭玉德高級工程師鑒定為豆科植物美麗崖豆藤的根薯部；用水洗凈后晾干，于50 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎，保存于干燥器中。

沒食子酸對照品（純度≥98%，合肥博美生物科技有限責任公司）；福林酚（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸鈉和無水乙醇（分析純，西隴科學股份有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；2, 2’-二氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·，純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；抗壞血酸（純度≥99%，成都市科龍化學品有限公司）。

1.2 儀器與設備

UV-2601雙光束紫外可見分光光度計[北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司]；電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-40B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試液的制備

牛大力粉末→乙醇浸泡→超聲提取→離心并收集上清液→重復提取并合并上清液→供試液

1.3.2 樣品含量的測定及計算

將供試液稀釋數倍，準確移取1 mL供試液，加水至5 mL，加入福林酚試劑和20%碳酸鈉溶液，用水定容至10 mL，水浴加熱，速冷，測定吸光度，并按式（1）計算樣品中總酚酸的提取量。

式中：X為總酚酸提取量，mg/g；ρ為根據標準曲線計算得到的總酚酸質量濃度，mg/mL；V為待測液體積，mL；N為樣品稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.3.3 牛大力總酚酸提取工藝優化

1.3.3.1 單因素試驗考察

準確稱取1.000 0 g牛大力粉末，依次考察料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）、乙醇體積分數（30%，40%，50%，60%和70%）、超聲功率（250，350，400，450和500 W）、超聲溫度（30，40，50，60和70 ℃）、超聲時間（10，30，60，90和120 min）和超聲次數（1，2和3次）對總酚酸提取量的影響。

1.3.3.2 正交優化試驗考察

基于單因素試驗結果，采用L9(34)正交試驗優選提取條件，選取的四因素及三水平見表1。

表1 正交試驗的因素及水平

1.3.4 牛大力總酚酸測定條件優化

準確移取0.5 mL 0.2 mg/mL沒食子酸對照品貯備液，依次考察福林酚用量（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL）、反應放置時間（0，1，5，10和15 min）、20%碳酸鈉溶液用量（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL）、水浴溫度（40，50，60，70和80 ℃）和水浴時間（10，20，30，40和50 min）對吸光度的影響。

1.3.5 牛大力總酚酸抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

分別移取2 mL 0.010，0.025，0.050，0.100，0.150，0.200和0.250 mg/mL的供試液，加入2 mL 0.1mmol/L DPPH溶液，避光處反應30 min，在517 nm處進行測定，所得吸光度標記為A樣品；移取2 mL無水乙醇，加入2 mL DPPH溶液，按上述方法進行測定，所得吸光度標記為A空白；分別移取2 mL上述不同濃度的供試液，加入2 mL無水乙醇，按上述方法進行測定，所得吸光度標記為A對照。其中，無水乙醇作為參比，維生素C作為陽性對照。DPPH自由基清除率按式（2）計算。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力的測定

參考李斌等[20]的方法制備ABTS工作液。分別移取1 mL與1.3.5.1小節相同濃度的供試液，加入2 mL ABTS工作液，在734 nm處進行測定，所得吸光度標記為A樣品；移取1 mL無水乙醇，加入2 mL ABTS工作液，在734 nm處進行測定，所得吸光度標記為A空白。其中，無水乙醇作為參比，維生素C作為陽性對照。ABTS自由基清除率按式（3）計算。

2 結果與討論

2.1 牛大力總酚酸提取的單因素試驗

2.1.1 料液比對牛大力總酚酸提取量的影響

如圖1所示，總酚酸提取量隨液比增大呈現先增后減的趨勢，說明提取溶劑體積對提取的影響相當顯著。當酚酸物質溶出量達到飽和時，繼續增大溶劑體積導致總酚酸提取量減小。因此，最佳料液比為1∶60 g/mL。

圖1 料液比對總酚酸提取量的影響

2.1.2 乙醇體積分數對牛大力總酚酸提取量的影響

如圖2所示，總酚酸提取量與乙醇體積分數之間先呈現正相關后變成負相關的情況。負相關時提取量減小的原因是較大體積分數的乙醇可溶出更多的醇溶性雜質，從而限制了酚酸物質的溶出。因此，最佳乙醇體積分數為50%。

圖2 乙醇體積分數對總酚酸提取量的影響

2.1.3 超聲功率對牛大力總酚酸提取量的影響

如圖3所示，超聲功率增大引起總酚酸提取量增加，這是因為功率越大，空化效應越劇烈，細胞破壞率增加，易于酚酸提取。過大的超聲功率反而溶出大量雜質，影響酚酸提取。因此，最佳超聲功率為400 W。

圖3 超聲功率對總酚酸提取量的影響

2.1.4 超聲溫度對牛大力總酚酸提取量的影響

如圖4所示：超聲溫度較低時，分子運動速率小，導致酚酸溶出速度較慢；超聲溫度升高后，分子運動速率加快，酚酸提取量明顯升高；超聲溫度過高，一些揮發性成分會揮發損失或熱不穩定的雜質會與酚酸競爭溶出，影響提取量。因此，最佳超聲溫度為60 ℃。

圖4 超聲溫度對總酚酸提取量的影響

2.1.5 超聲時間對牛大力總酚酸提取量的影響

如圖5所示：總酚酸提取量隨超聲時間增加呈先增后減趨勢，說明超聲有利于有效成分析出；超聲時間越長，細胞破碎程度越大，細胞內物質析出越多，提取量越高；超過30 min后，細胞被破壞得更細碎，析出的雜質吸附酚酸，同時部分酚酸物質會被氧化或分解，導致提取量降低。因此，最佳超聲時間為30 min。

圖5 超聲時間對總酚酸提取量的影響

2.1.6 提取次數對牛大力總酚酸提取量的影響

如圖6所示，提取次數與總酚酸提取量之間呈現正相關關系，表明提取次數越多，酚酸提取越完全。綜合考慮成本和時間，最佳提取次數為2次。

圖6 提取次數對總酚酸提取量的影響

2.2 牛大力總酚酸提取的正交優化試驗

2.2.1 正交優化試驗結果與分析

正交優化試驗結果如表2所示，各因素對牛大力酚酸提取的影響主次順序為C＞B＞A，最佳提取組合為A2B2C3，即料液比1∶60 g/mL、乙醇體積分數50%、超聲時間60 min。方差分析結果如表3所示，C、B因素有統計學意義，A因素無統計學意義。

表2 正交設計試驗方案與結果

表3 方差分析表

2.2.2 驗證試驗

按正交最佳提取組合進行3次平行試驗，所得平均提取量為39.65 mg/g，SRSD為0.74%（n=3），說明此提取工藝穩定。

2.3 牛大力總酚酸測定條件優化

2.3.1 測定波長的選擇

精密移取對照品貯備液和供試液各0.5 mL，按1.3.2小節方法顯色，以水加顯色劑為參比，在300～900 nm波長范圍內進行光譜掃描，結果顯示兩者均在720 nm處出現最大吸收峰，因此選擇720 nm作為測定波長。

2.3.2 福林酚用量對吸光度的影響

在堿性條件下，酚酸可與福林酚試劑發生氧化還原反應，生成藍色化合物，因此福林酚用量直接影響底物顯色。如圖7所示，福林酚用量不足1 mL時，顯色不完全。因此，福林酚用量確定為1 mL。

圖7 福林酚用量對吸光度的影響

2.3.3 反應放置時間對吸光度的影響

如圖8所示，加入福林酚試劑后，無需等待反應，說明此反應迅速。因此，反應放置時間確定為0 min。

圖8 反應放置時間對吸光度的影響

2.3.4 20%碳酸鈉溶液用量對吸光度的影響

碳酸鈉溶液用量同樣影響底物顯色。如圖9所示，當其用量為1 mL時，吸光度達到最大，說明此時底物已完全顯色。因此，20%碳酸鈉溶液用量確定為1 mL。

圖9 碳酸鈉溶液用量對吸光度的影響

2.3.5 水浴溫度對吸光度的影響

水浴溫度的高低直接影響酚酸類物質的穩定性。如圖10所示，吸光度隨著水浴溫度的增加而先增后減。因此，水浴溫度確定為60 ℃。

圖10 水浴溫度對吸光度的影響

2.3.6 水浴時間對吸光度的影響

水浴時間的長短直接影響底物的顯色是否完全。如圖11所示，吸光度隨著水浴時間的增加而先增后減。因此，水浴時間確定為20 min。

圖11 水浴時間對吸光度的影響

2.4 線性關系考察

分別準確移取0，0.05，0.10，0.20，0.40和0.60 mL對照品貯備液，按1.3.2小節方法顯色，在720 nm處測定吸光度。以沒食子酸的質量濃度（ρ）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線?？疾旖Y果顯示，線性方程為A=119.55ρ+0.007，r=0.999 9，表明0.001～0.012 mg/mL的沒食子酸與A720值呈現良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

將同一份供試液連續測定6次，所得平均提取量為39.47 mg/g，SRSD為0.16%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取6份同一批牛大力樣品進行測定。所得平均提取量為39.73 mg/g，SRSD為1.36%（n=6），說明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

2.7.1 顯色穩定性試驗

將同一份供試液分別于顯色結束0～120 min內，每間隔10 min測定。所得平均提取量為39.85 mg/g，SRSD為1.57%（n=12），說明供試液在顯色120 min內穩定。

2.7.2 樣品穩定性試驗

將同一份供試液于室溫分別放置0，2，4，8，12，24，36和48 h后測定。所得平均提取量為39.47 mg/g，SRSD為2.10%（n=8），說明供試液在48 h內穩定。

2.8 加標回收試驗

精密稱取9份同一批牛大力樣品，每3份1組，每組分別添加3個水平的沒食子酸對照品，測定結果如表4所示。結果顯示，該方法準確度高、回收率高。

表4 牛大力中總酚酸加標回收試驗結果

2.9 樣品的測定

將采自廣西不同產地的14個牛大力樣品進行測定。結果顯示，廣西不同產地的牛大力總酚酸含量略有差異，含量范圍為21.17～44.22 mg/g，SRSD為0.79%～2.77%。

2.10 牛大力總酚酸抗氧化活性研究與分析

2.10.1 清除DPPH自由基能力

如圖12所示，牛大力酚酸對DPPH自由基清除能力與其濃度呈現正相關關系。其中最大DPPH清除率可達95.1%。與維生素C相比，牛大力酚酸弱于維生素C。

圖12 對DPPH自由基清除能力

2.10.2 清除ABTS自由基能力

如圖13所示，牛大力酚酸對ABTS自由基清除能力與其濃度呈現正相關關系。其中最大ABTS清除率可達95.5%。與維生素C相比，牛大力酚酸弱于維生素C。

圖13 對ABTS自由基清除能力

3 結論

試驗提出牛大力總酚酸提取工藝，確定最優工藝條件：料液比1∶60 g/mL、乙醇體積分數50%、超聲功率400 W、超聲溫度60 ℃、超聲時間60 min、超聲次數2次；該提取工藝可為牛大力深加工和價值開發提供借鑒。試驗建立牛大力總酚酸含量測定方法，確定最優條件：測定波長720 nm、福林酚用量1 mL、反應放置時間0 min、碳酸鈉溶液用量1 mL、水浴溫度60℃、水浴時間20 min；該方法簡單快速、準確穩定，適用于牛大力總酚酸含量的測定，可作為牛大力質量控制的定量方法。試驗提供廣西牛大力總酚酸含量范圍，可為后續全面建立廣西牛大力質量標準提供參考依據。試驗研究發現牛大力總酚酸對DPPH自由基和ABTS自由基均具有較強的清除能力。綜上所述，試驗結果對牛大力深加工產品的開發具有重要現實意義。