黃果梨口服液制備工藝優化及體外抗氧化活性的研究

魏占楠，葉英*，敏飛，才讓加，王樹林，梁欣悅

1. 青海大學農牧學院（西寧 810016）；2. 青海省同仁市工業商務和信息化局（西寧 811300）

同仁黃果梨俗稱酸果，《中國植物志》一書中以黃果命名。同仁黃果梨是青海省黃南藏族自治州同仁縣的特產，同仁縣隆務地區被譽為中國的“黃果之鄉”，黃果梨是白梨系統的青海地方梨品種之一，受獨特的自然因素的影響，造就同仁黃果梨果實碩大、皮薄松軟、色澤金黃、酸甜適度、清香沁人、汁多籽少、耐貯藏、營養豐富[1]的特點。同仁黃果梨在生津止渴、清痰化瘀、清熱解表、消食調胃，保肝護胃等方面具有獨特的醫藥、保健功能，是天然的綠色保健品的優質原料。

枸杞作為營養豐富的小漿果類食品，果實中的功能成分主要是枸杞多糖、黃酮和類胡蘿卜素，這些功能成分與枸杞果實的抗氧化活性密切相關[2]，其中胡蘿卜素具有很強的抗氧化能力[3-4]；菊花味甘苦，有散風清熱、消炎解毒等功效[5]，其中黃酮類化合物具有抗菌、降血脂、抗氧化等良好的保健功能[6-8]；100%純沙棘原漿富含黃酮及不飽和脂肪酸等活性成分，具有顯著的抗氧化與保健功能[9-10]。

試驗以黃果梨浸膏、菊花浸膏、枸杞浸膏和100%純沙棘原漿為原料，研制黃果梨口服液，測定口服液抗氧化能力，為同仁黃果梨產品開發提供理論基礎，并提高加工利潤和產品層次，使青海省黃果梨擁有廣泛的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

黃果梨（采摘自青海省同仁縣）；枸杞（采摘自寧夏頭茬特技枸杞）；菊花（上海梅家塢茶業有限公司）；100%純沙棘原漿（寧夏福壽康大健康生物科技有限公司）；白砂糖（食品級，北京廚大媽食品集團有限公司）；果膠酶（食品級，河南萬邦實業有限公司）；纖維素酶（食品級，河南萬邦實業有限公司）；ABTS（上海源葉生物科技有限公司）；等。

R-1050型旋轉蒸發儀（鄭州長城科工茂有限公司）；LR10M型多功能智能離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；MultskanSky型微量核酸蛋白測定儀（Thermo Fisger Scientific）；721N型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-800D型臺式醫用數控超聲波清洗儀（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；WF-B2000榨汁機（永康市天歌電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃果梨口服液配比優化試驗

1.2.1.1 黃果梨口服液的制備

工藝流程：原材料預處理→凈化→浸提→濾液→濃縮液→分裝→灌封→滅菌→成品。

操作要點：取黃果梨，洗凈，通過榨汁機得到黃果梨汁，果膠酶[11]和纖維素酶[12]加入量控制在0.15%，水浴酶解后過濾，抽濾，得到澄清梨汁，后將其在60℃下旋轉蒸發1 h至黏稠狀，得到黃果梨浸膏。枸杞、菊花采用煎煮法浸提，在加水量10倍、提取時間1.5 h、煎煮次數2次，浸提液在60 ℃的條件下旋轉蒸發1 h至黏稠狀，得到枸杞、菊花浸膏。按單因素試驗設計的口服液原料配方比進行配制，加入0.05%的黃原膠[13]作為穩定劑，攪拌混勻后，以4 500 r/min離心15 min，過濾，分裝至棕色口服液瓶中，密封。巴氏殺菌105 ℃，30 min，自然冷卻至室溫，即得成品。

1.2.1.2 黃果梨口服液感官評價

表1 黃果梨口服液感官評分表

選擇10位品評員組成感官評定小組，參照趙儷穎等[14]的感官評分標準對制備的黃果梨口服液的色澤、香味、滋味和組織形態做出評定。

1.2.1.3 黃果梨口服液單因素試驗

固定其他因素及相應水平，以黃果梨感官評分為指標，研究黃果梨浸膏、枸杞浸膏、菊花浸膏、白砂糖、100%純沙棘原漿的添加量對黃果梨口服液感官評分的影響。設計各因素水平：黃果梨添加量10%，20%，30%，40%和50%；枸杞浸膏添加量15%，25%，35%，45%和55%；菊花浸膏添加量5%，10%，15%，20%和25%；白砂糖添加量8%，12%，16%，20%和24%；100%純沙棘原漿添加量1%，2%，3%，4%和5%，進行單因素試驗，確定最佳添加量。

1.2.1.4 黃果梨口服液配比響應面試驗

根據單因素試驗結果，以黃果梨浸膏添加量、枸杞浸膏添加量、菊花浸膏添加量、白砂糖添加量和100%純沙棘原漿添加量為影響因素，以感官評分的分數為響應值，進行五因素三水平的響應面試驗。試驗因素水平設計見表2。

表2 響應面設計因素水平表 單位：%

1.2.2 黃果梨口服液成分測定

1.2.2.1 總黃酮含量測定

參考史巧霞等[15]的方法，繪制蘆丁標準曲線，得到回歸方程y=20.422x-0.013 5，R2=0.999 5。采用Na NO2-Al(NO3)3比色法[16]測定總黃酮的吸光度，并按式（1）計算樣品中總黃酮含量（mg/g）。

式中：c為提取液總黃酮的質量濃度，mg/mL；v為提取液總體積，mL；N為稀釋倍數；M為樣品質量，g。

1.2.2.2 總多酚含量測定

參考許玲玉等[17]的方法，繪制沒食子酸標準曲線，得到回歸方程y=7.627 9x-0.189 9，R2=0.999 5。并按式（2）計算樣品中總多酚含量（mg/g）。

式中：c為提取液總多酚的質量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為樣品質量，g。

1.2.2.3 多糖含量測定

參考侯演林等[18]的方法，采用苯酚-硫酸法，繪制葡萄糖標準曲線，得到回歸方程y=0.085 1x+0.021 5，R2=0.999 5。并按式（3）計算樣品中多糖含量（mg/g）。

式中：c為多糖中葡萄糖質量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數；m為黃果梨干粉質量，g。

1.2.2.4 可溶性固形物測定

參考NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》測定樣品中可溶性固形物含量。

1.2.3 黃果梨口服液體外抗氧化活性研究

1.2.3.1 DPPH、O2-·、H2O2、·OH自由基清除率測定

根據劉仙俊等[19]的方法，測定黃果梨口服液對DPPH自由基、超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）的清除率，按照式（4）計算出供試樣的自由基清除率。

式中：Ax為樣品吸光度；Ax0為陽性對照吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.2.3.2 ABTS自由基清除率測定

ABTS自由基清除率測定根據劉茂等[20]的方法，待測樣品和ABTS工作液以1∶4混合，室溫避光反應10 min后，在734 nm波長處測吸光度。以抑制率表示自由基清除能力大小，按式（5）計算[21]。

式中：Asample為樣品+ABTS工作液的吸光度；Asampleblack為樣品+去離子水的吸光度；Acontrol為去離子水+ABTS工作液的吸光度；Acontrolblack為去離子水的吸光度。

1.3 數據分析

試驗中圖表均采用Origin 2018繪制。采用SPSS 21.0軟件進行試驗數據分析，試驗統計數據以平均值±標準差（X±SD，n=3）表示，以P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 黃果梨口服液配比工藝優化試驗結果

2.1.1 黃果梨口服液配比單因素試驗結果

2.1.1.1 白砂糖添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

白砂糖添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（a）。隨著白砂糖添加量的增加，黃果梨口服液的感官評分呈現線上升后下降趨勢，白砂糖添加量小于12%時，酸味大于甜味，口感不協調；白砂糖添加量大于12%時，黃果梨口服液口感偏甜，掩蓋梨汁原有的風味，口感較膩，可接受度較低。白砂糖添加量12%時黃果梨口服液酸甜適度，滋味純正，協調柔和，可作為矯味劑以均衡黃果梨偏酸的口感，酸甜口感層次分明，風味最佳。故確定白砂糖添加量12%時口感最佳。

2.1.1.2 菊花浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

菊花浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（b）。隨著菊花添加量的增加，黃果梨口服液的感官評分呈現先上升后下降趨勢，菊花味甘苦，氣味較大[22]，經過提取濃縮之后，菊花味濃郁，如果菊花浸膏添加量小于10%，菊花特有的甘苦味口感會下降不突出；如果菊花浸膏添加量超過10%，會影響口服液整體口感，甘苦味加重，掩蓋了黃果梨特有的清香，故確定菊花浸膏的添加量為10%時最佳。

2.1.1.3 枸杞浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

枸杞浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（c）。隨著枸杞浸膏的增加，黃果梨口服液的感官評分呈先上升后下降趨勢，枸杞浸膏添加量小于35%時，枸杞味比較淡，枸杞風味不是很突出；枸杞浸膏添加量超過35%時，雖然隨著枸杞的增加量，其抗氧化活性也會隨之增加[23]，但枸杞風味會過于濃郁，感官評分有所下降；枸杞浸膏添加量35%時，口感柔和協調，各種風味層次分明，感官評分最高；故確定枸杞浸膏添加量35%時最佳。

2.1.1.4 黃果梨浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

黃果梨浸膏添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（d）。隨著黃果梨浸膏的增加，黃果梨口服液的感官評分呈先上升后下降趨勢，添加量低于40%時，枸杞風味掩蓋黃果梨風味，口感不協調；添加量超過40%時，具有濃郁的黃果梨香氣，但口感過酸；黃果梨浸膏添加量為40%時，黃果梨口服液風味獨特，酸甜可口，感官評分最高；故確定黃果梨浸膏添加量40%時最佳。

2.1.1.5 100%純沙棘原漿添加量對黃果梨口服液感官評分的影響

100%純沙棘原漿添加量對黃果梨口服液感官評分的影響見圖1（e）。隨著100%純沙棘原漿的增加，黃果梨的感官評分呈先升高后降低趨勢，添加量3%時，感官評分最高，口感適中，具有黃果梨枸杞沙棘等特有的風味；100%純沙棘原漿添加量超過3%時，黃果梨口服液的感官評分下降，沙棘特有的酸味過重，黃果梨枸杞等風味被沙棘的香氣掩蓋，口感不協調，香氣不平衡。故確定100%純沙棘原漿添加量為3%時最佳。

圖1 黃果梨口服液配比單因素試驗結果

2.1.2 黃果梨口服液配比響應面試驗結果

在單因素試驗分析基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計五因素三水平共46組響應面分析試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3可知，對試驗結果進行多元回歸方程分析，得到回歸方程：感官評分=-173.140 63+5.412 50A+4.022 92B+1.887 50C+10.729 17D+11.937 50E+0.000 000AB-0.010 000AC-0.025 000AD+0.000 000AE-0.010 000BC-0.025 000BD+0.150 00BE+0.000 000CD-0.050 000CE-0.125 00DE-0.082 292A2-0.057 292B2-0.052 500C2-0.274 74D2-2.145 83E2，方程二次項系數均為負數，故方程有最大值，符合試計要求。

表3 Box-Behnken設計方案及結果

由表4可知，該試驗模型P＜0.01（極顯著），失擬項P=0.726 4（不顯著），模型相關系數R2=0.844 6，說明該模型設計較為合理，能夠擬合試驗數據，可用于黃果梨口服液原料配比的分析和預測。在所設計的試驗范圍內各因素對黃果梨口服液的感官評分的影響依次為100%純沙棘原漿＞枸杞浸膏＞黃果梨浸膏=白砂糖＞菊花浸膏。

表4 回歸方程顯著性檢驗與方差分析

2.1.3 各因素交互效應分析

為研究各因素對感官評分的影響，繪制響應面圖，響應面坡度可以反映2個因素交互作用對響應值的影響程度，坡度越大表示影響越大。等高線的形狀反映2個因素交互作用的顯著性，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[24]。

圖2 各因素交互作用對感官評分影響的響應面圖

2.1.4 驗證試驗

黃果梨口服液的原料配比根據響應面試驗最優條件，進行3次驗證試驗。按響應面優化得到最優條件，設定黃果梨浸膏添加量35.28%、枸杞浸膏添加量29.88%、菊花浸膏添加量10.13%、白砂糖添加量15.78%及100%純沙棘原漿添加量3.44%；平行試驗3次后，實際測得的感官評分為91分，預測值為93.40分，相對誤差只有0.97%，說明回歸模型的準確性和可信度較高，驗證該模型的有效性。

2.1.5 黃果梨口服液成分及含量檢測結果

由于原料以浸膏形態加入，濃度較大，導致總多糖、黃酮、總多酚含量比較高，其中總黃酮含量達34.54mg/g，總多糖含量達27.86 mg/g，總酚含量達24.56 mg/g。

表5 黃果梨口服液成分含量表

2.1.6 黃果梨口服液體外抗氧化試驗結果分析

黃果梨口服液對DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除、超氧陰離子自由基（O2-·）清除率、羥基自由基（·OH）清除率、過氧化氫自由基（H2O2）清除率結果見圖3。

圖3 黃果梨口服液的抗氧化活性研究

根據劉晶晶等[25]口服液的抗氧化活性研究表明，不同質量濃度下的口服液抗氧化活性隨著溶液質量濃度的增大逐漸增強，浸膏的狀態加入，對提高黃果梨口服液的風味和抗氧化能力是有益的。在阿不都維力·阿不都爾尼等[26]的玫菊口服液、史瑞琴等[27]的小球藻多糖口服液和馬濤等[28]的牛磺酸大豆蛋白口服液抗氧化活性研究中均對自由基有一定清除作用。

DPPH·作為一種穩定性較好的自由基，黃果梨口服液DPPH自由基清除率為60.00%；ABTS法是作為測定自由基清除率能力的較為廣泛的間接檢測方法，黃果梨口服液對其的清除率最高，為91.10%；O2-·自由基一般會導致細胞的損傷、衰老等，在黃果梨口服液中O2-·清除率為86.20%；·OH的氧化性極高，有強毒害性，是導致人體產生各種疾病的原因之一，黃果梨口服液對其的清除率為67.44%；H2O2對人體的傷害與自由基類似，損害人體內生物大分子，導致人體細胞衰老，是產生各類復雜疾病的重要原因，黃果梨口服液對其的清除率為85.80%。

3 結論

試驗以黃果梨浸膏為主要原料，輔以枸杞浸膏、菊花浸膏、白砂糖、100%純沙棘原漿，以感官評分為評價指標，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面設計優化，確定黃果梨口服液最佳配方：黃果梨浸膏35.28%、枸杞浸膏29.88%、菊花浸膏10.13%、白砂糖15.78%、100%純沙棘原漿3.44%。該配方所制備黃果梨口服液樣品風味獨特，組織狀態均勻，具有黃果梨清香及枸杞、菊花和沙棘的獨特風味，口感酸甜適宜，感官評分最高91分。在原料最佳配比條件下，對ABTS自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫自由基（H2O2）、DPPH自由基的清除率分別為91.10%，86.2%，85.8%和60%。抗氧化性試驗分析顯示黃果梨口服液具有一定抗氧化性。試驗為黃果梨后續抗氧化產品及相關功能性產品的研發提供一定理論依據，為黃果梨高原特色資源的開發利用奠定基礎，但其功能特性和結構特性等其他方面有待進一步深探。