鐵皮石斛鮮花中多酚氧化酶的酶學特性

夏瑜，張珍林, ，閔運江, ，劉紫薇，耿曾奇，王明暉

1. 皖西學院生物與制藥工程學院（六安 237012）；2. 植物細胞工程安徽省工程技術研究中心（六安 237012）；

3. 安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室（六安 237012）

鐵皮石斛花是蘭科草本鐵皮石斛（Dendrobium officinaleLimura et Migo）植物開的淡黃色花。純天然鐵皮石斛較喜在濕潤、陰暗的山谷或巖層中生長[1-2]，其發源地多處于安徽、福建、浙江等地，作為我國傳統的一味中藥材，據記載其效用有潤肺、益腎、養胃、明目等。5—7月或10—11月是鐵皮石斛的花期，也是因為花期短[3]，前期主要針對鐵皮石斛干花的營養成分和多酚氧化酶的性質進行研究，研究發現在鐵皮石斛干花里通過儀器檢測出一定的營養成分且提取的多酚氧化酶具有酶活性，如鐵皮石斛干花中有必需氨基酸，有大量礦物元素，也含有一定量多糖化合物[4-5]；測定提取的干花中多酚氧化酶具有酶學活性[6]。

多酚氧化酶（polyphenoluxidase，PPO）又稱兒茶酚氧化酶，是一種金屬蛋白酶，屬于氧化還原酶六大類酶中的一種，常見于植物、微生物真菌、昆蟲質體等[7-8]。在人為干預條件下，多酚氧化酶容易引起食品顏色加深，影響食品質量劣變。但也有促進食品品質的作用[9-11]。

鐵皮石斛花干制時顏色會加深，在干制過程中采取一定手段盡量控制顏色加深的劣變反應發生，基于對這種現象問題的考慮，試驗旨在探究鐵皮石斛鮮花中多酚氧化酶的酶學性質，從易引起變化的酚類物質著手研究，從而能在鐵皮石斛花加工中更好利用酶的活性生產出外形、香氣、滋味優良的鐵皮石斛花再加工產品。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

鐵皮石斛鮮花（皖西學院植物園采?。?。

1.2 儀器與試劑

UV-5200紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-4C數顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；BCD-249CF冰箱（合肥美菱股份有限公司）；PHS-25酸度計（上海今邁儀器儀表有限公司）。

磷酸氫二鈉、抗壞血酸、鄰苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP）、磷酸二氫鈉（均為分析純）。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛鮮花PPO的提取

取5.0 g待測原料鐵皮石斛鮮花，在低溫條件下用處理后的剪刀將其剪碎到研缽中，添加0.85 g PVP、0.1 g抗壞血酸、60 mL冰浴0.02 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）、適量助研磨物質，在冰浴條件下研磨20 min；在4 ℃條件下浸提12 h，經布氏漏斗3層過濾網過濾浸提勻漿，過濾后的溶液在4 ℃、5 000 r/min條件下離心25 min，取上層清液制備得到粗酶液。

1.3.2 鐵皮石斛鮮花PPO活性測定

依次平行加入1 mL pH 7.2的0.02 mol/L磷酸緩沖溶液、1 mL 0.03 mol/L鄰苯二酚、1 mL粗酶液，混合均勻后，需要在40 ℃水浴鍋內保溫10 min，充分反應結束即刻在沸水中保溫5 s，測定吸光度在460 nm最佳波長下，每隔30 s測定1次，共記錄4 min，平行測定3組，取平均值，參照組用0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸緩沖液替代鄰苯二酚溶液。

PPO活性單位（U）用單位體積酶液表示，其產物每30 s 吸光度（A）變化0.001表示。

1.3.3 鐵皮石斛鮮花多酚氧化酶的酶學性質的測定

1.3.3.1 緩沖液pH對PPO活性影響

分別吸取1 mL pH在5.8～7.0范圍的磷酸緩沖液且以0.4為等差梯度吸取，其他條件不變，參照1.3.2小節中的條件研究鐵皮石斛鮮花PPO的活力，研討PPO活性受pH影響的程度。

1.3.3.2 底物濃度對PPO活性的影響

分別吸取1 mL濃度0.005，0.010，0.030和0.050mol/L的鄰苯二酚，其他條件不變，參照1.3.2小節中的條件研究鐵皮石斛鮮花PPO活力，研討PPO活性受底物濃度影響的程度。

1.3.3.3 溫度對PPO活性的影響

按照1.3.2小節中的方法吸取溶液，分別在20，30，40和50 ℃恒溫水浴下保溫10 min，其他條件不變，參照1.3.2小節中的條件研究鐵皮石斛鮮花PPO活力，研討PPO活性受反應溫度影響的程度。

1.3.3.4 酶添加量對PPO活性的影響

依次吸取1 mL 0.02 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液、1 mL 0.03 mol/L鄰苯二酚溶液，依次吸取1 mL體積0.5～2 mL且以0.5 mL為等差梯度吸取的粗酶液，在40℃恒溫水浴下保溫10 min后混合均勻，其他條件不變，參照1.3.2小節中的條件研究鐵皮石斛鮮花PPO活力，研討PPO活性受酶添加量影響的程度。

1.3.3.5 不同抑制劑對PPO的影響

取一定量粗酶液，依次加入1 mL濃度0.2～0.8 mg/mL且以0.2為等差梯度吸取的EDTA-2Na、NaCl和抗壞血酸，吸取1 mL 0.02 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液和1 mL 0.03 mol/L鄰苯二酚溶液，在40 ℃恒溫水浴下保溫10min后混合均勻，其他條件不變，參照1.3.2小節中的條件研究鐵皮石斛鮮花PPO活力，研討PPO活性受不同抑制劑的程度。

2 結果與分析

2.1 緩沖液pH對鮮花PPO活性的影響

如圖1所示，pH在5.8～6.2，PPO活力顯著上升；pH在6.2～8.2，PPO活性檢測下降。據此，定鐵皮石斛鮮花PPO的pH 6.2為最佳。

分析圖1結果可知，鐵皮石斛鮮花PPO活性受緩沖液pH影響較大，在強酸或堿性的條件下，PPO活性都很低。其主要原因與多酚氧化酶的螯合結構有關，作為配位氧化還原物質其分子結構上螯合銅元素，其結構中的Cu在堿性條件下以沉淀形式析出，因此直接影響其活性。由此可得，鐵皮石斛鮮花PPO在弱酸條件下較容易保存，pH過高或過低都不利于其保存，此性質可應用在鐵皮石斛鮮花的生產加工中。

圖1 緩沖液pH對PPO活性的影響

2.2 底物濃度對PPO活性的影響

由圖2所示，在0.005 mol/L＜底物濃度＜0.01 mol/L這個范圍內，底物濃度對酶活的曲線近似呈線性，0.01 mol/L＜底物濃度＜0.03 mol/L這個范圍內，變化緩慢，底物濃度＞0.03 mol/L后變化曲平，幾乎無變化。由此可見，鐵皮石斛鮮花PPO的最佳底物濃度為0.03 mol/L。

分析圖2結果，底物濃度對PPO酶活性的影響在反應初期呈正比，隨著反應的深入，伴隨PPO活性的逐漸減弱，此時再繼續增大底物濃度，直到酶的催化反應完全完成，但PPO酶的催化反應能力達到最大，底物及生成的產物對酶可能會產生競爭性抑制[12]，導致PPO活性呈現緩慢變化的趨勢。

圖2 底物濃度對PPO活性的影響

2.3 溫度對PPO活性的影響

從圖3可以得到，溫度T＜20 ℃時，反應幾乎沒變化，20 ℃＜T＜40 ℃時，顯示出溫度對PPO活性的重要影響；其中，20 ℃＜T＜30 ℃時，PPO活性上升，T＞30 ℃時，PPO活性下降；在40 ℃＜T＜50 ℃時，PPO活性下降到最低，繼續增加溫度無反應；結合試驗得出，鐵皮石斛鮮花PPO活性的最適溫度為30 ℃。

分析圖3曲線變化結果，得出在較低的溫度范圍內，隨著溫度的升高，PPO分子與底物鄰苯二酚分子熱運動劇烈，使二者一定反應時間內發生碰撞的概率增加，PPO顯示出高活性；持續升溫一段時間，PPO分子結構受到破壞，喪失部分活性，表現為整體反應曲線負增長；所以，在鐵皮石斛鮮花中提取的PPO最適活性溫度條件為30 ℃左右，過高或過低的溫度都不適合其酶反應[13]。

圖3 溫度對PPO活性的影響

2.4 酶添加量對PPO活性的影響

如圖4所示，反應前期隨酶液添加量增多，酶活性逐漸升高，添加量1 mL時，PPO紫外反應活性達到最高，酶液繼續添加，PPO活性出現下降趨勢，由此可以得出，酶添加量1 mL時鐵皮石斛鮮花PPO活性最強。

分析圖4的圖像趨勢發現，酶液添加量在0.5～1 mL范圍內，隨著酶添加量增加，酶吸光度在0～15 s內變化迅速，反應速率快，酶與底物生成的產物在增多，同時酶活性表現也很強；在不改變底物濃度的條件下，繼續增加酶液體積，測定發現酶活性逐漸降低；在有足夠底物的情況下，酶的濃度與反應活性呈正比[14]，說明在試驗溶液里底物濃度有限。

圖4 酶添加量對PPO活性的影響

2.5 不同抑制劑對PPO的影響

如圖5所示，試驗選取的3種抑制劑對鐵皮石斛鮮花PPO活性存在不同程度影響，抑制劑百分比濃度增大時，均呈現PPO活性降低的趨勢。在抑制劑百分比濃度低范圍時，抑制PPO活性EDTA-2Na和抗壞血酸效果幾乎一致，隨著質量濃度的增加，二者抑制效果逐漸呈現差異，可以看出，3種抑制劑中，抑制效果最好的是抗壞血酸，其次是EDTA-2Na，最后是NaCl。

分析圖5結果發現，NaCl、EDTA-2Na和抗壞血酸對PPO活性均具有抑制效果，但NaCl和EDTA-2Na是常用的金屬絡合物，兩者的抑制效果比較弱，通常很少單獨使用；抗壞血酸是一種有機酸，不僅具有絡合金屬元素的作用還可以降低反應pH，一方面能夠絡合PPO中的Cu2+，另一方面也能夠降低PPO反應的最適pH，從而使酶反應活性降低較大[15]。

圖5 不同抑制劑對PPO活性的影響

3 結論與討論

試驗對鐵皮石斛鮮花中PPO的酶學性質進行研究。PPO提取液1 mL，鄰苯二酚作為底物進行測定，得到鐵皮石斛鮮花PPO的最適pH 6.2、最適底物濃度0.03 mol/L、最適溫度30 ℃，其中在對3種抑制劑的試驗中，抗壞血酸作為抑制劑對PPO活性的抑制效果最好，EDTA-2Na、NaCl的效果相對較差。

前期對鐵皮石斛干花的酶學性質進行研究[22]，鑒于2次試驗研究原料來源相同，但試驗結果存在一些差異，主要體現：鐵皮石斛鮮花的pH 6.2、干花的pH 7.0；鐵皮石斛鮮花的底物濃度0.03 mol/L最佳，干花的底物濃度0.05 mol/L最佳；鐵皮石斛鮮花的最佳溫度30 ℃、干花的最佳溫度35 ℃。分析原因可能是鐵皮石斛花經過干制脫水后，在恒定溫度下，水分減少、水分活度降低，從而PPO的活性也有所減低。因此，理論上來說食品深加工應用鐵皮石斛鮮花比干花要好，但實際上鮮花不易儲藏，采摘后必須經過合適脫水處理才能保存下來，所以，在食品加工應用時可以考慮不需要高溫處理的方法對鐵皮石斛花進行干制后再使用。

試驗研究鐵皮石斛鮮花中PPO的酶學性質，為后期開發鐵皮石斛鮮花深加工食品提供一定理論數據，也為食品研制過程出現劣變化學現象提供參考依據。