不同種、產(chǎn)地、生長期的肉蓯蓉中苯乙醇苷類含量比較

向玲，梅小樂，羅華秀，王松濤，王曉玲，焦威

1. 中國科學(xué)院成都生物研究所（成都 610041）；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)（呼和浩特 010018）；3. 瀘州品創(chuàng)科技有限公司（瀘州 646000）；4. 西南民族大學(xué)藥學(xué)院（成都 610041）

肉蓯蓉是我國西部少數(shù)民族地區(qū)習(xí)用藥材，活性成分豐富，藥效顯著，被冠以“沙漠人參”的美譽(yù)[1]。《中國藥典》2015版收載肉蓯蓉的用藥來源為列當(dāng)科植物肉蓯蓉或管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖[2-3]，并將松果菊苷和毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的標(biāo)定成分?；哪馍惾睾凸芑ㄈ馍惾丶蟹植加谖覈狈降纳衬貐^(qū)，二者功效相似，均具有補(bǔ)腎益精的功效，主要用于改善陽痿早泄、潤腸通便、補(bǔ)充營養(yǎng)、提高免疫力等。從肉蓯蓉屬植物中分離鑒定的化學(xué)成分主要有苯苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類[4]，其中，苯乙醇苷類化合物種類、含量豐富[5-7]，是評(píng)價(jià)肉蓯蓉質(zhì)量最重要的指標(biāo)[8-9]。苯乙醇苷類成分具有較高的藥用價(jià)值，是其主要的活性物質(zhì)，其中肉蓯蓉苷A具有抗炎[10]和抗氧化活性[11]，松果菊苷具有抗衰老[12]和神經(jīng)保護(hù)作用[13-15]，毛蕊花糖苷也具有抗炎活性[16]及神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

研究人員通過高效液相色譜、超高效液相色譜、核磁共振等技術(shù)對(duì)肉蓯蓉中苯乙醇苷類進(jìn)行成分研究[18-19]，發(fā)現(xiàn)不同采收期肉蓯蓉中各成分含量差異較大[20-22]，環(huán)境因素也會(huì)導(dǎo)致肉蓯蓉屬植物不同種、不同產(chǎn)地各成分之間的較大差異[23]。HPLC技術(shù)成為定性定量分析苯乙醇苷類成分的一種常用方法，該方法高效、可行。但是，針對(duì)肉蓯蓉的大部分研究主要集中在采收期肉質(zhì)莖的研究，對(duì)其吸器及花期前后的有效成分含量研究較少。

試驗(yàn)對(duì)肉蓯蓉進(jìn)行質(zhì)量研究，分析不同種、不同產(chǎn)地和不同生長期肉蓯蓉、荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷含量差異，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和合理利用肉蓯蓉資源提供數(shù)據(jù)參考，為評(píng)價(jià)肉蓯蓉質(zhì)量提供方法參考和用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī)（103B型，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；電子天平（AL104型，瑞士METTLERTOLEDO有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)型超純水機(jī)（WP-UPT-10，四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；移液槍（100～1 000 μL）；微量進(jìn)樣器（25 μL）；高效液相色譜儀[LC-16型，島津儀器（蘇州）有限公司]；Waters SunFireTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；超聲波清洗器（KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（SENCO W201型，上海申生科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R-201，無錫申生科技公司）；0.22 μm針頭式過濾器[島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司]。

1.2 材料

標(biāo)準(zhǔn)品松果菊苷（批號(hào)PS000867，成都普思生物科技股份有限公司）；肉蓯蓉苷A（批號(hào)19062804，上海源葉生物科技有限公司）；毛蕊花糖苷（批號(hào)wkq19070101，維克奇生物科技有限公司）；2-乙酰基洋丁香酚苷（批號(hào)B21779，上海源葉生物科技有限公司）。4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品純度均＞98%。

肉蓯蓉藥材（表1），將肉蓯蓉藥材切片，烘箱55 ℃烘干，打粉，繼續(xù)55 ℃烘干至恒重，粉末過0.212 mm（65目）篩，密封避光保存。

表1 不同種、不同生長期肉蓯蓉樣品編號(hào)及其來源

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取3.6 mg松果菊苷、3.0 mg肉蓯蓉苷A、4.5 mg毛蕊花糖苷、2.4 mg 2-乙酰基洋丁香酚苷標(biāo)準(zhǔn)品，分別用80%甲醇溶解并定容到10 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取上述儲(chǔ)備液各1 mL，分別定容至10 mL棕色容量瓶，即得對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.036 0，0.030 0，0.045 0和0.024 0 mg/mL。溶液低溫、避光保存。

1.3.2 供試品溶液

稱取1.0 g樣品粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量并浸泡30 min，超聲40 min（功率120 W，頻率40kHz），放至室溫，稱定質(zhì)量，補(bǔ)足失重，搖勻，靜置，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

采用Inert Sustain WR5-5085 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.5%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫：0～10 min，15%～17% B；10～30min，17%～19% B；30～40 min，19%～28% B；40～45 min，28%～80% B；45～60 min，80%～90% B。進(jìn)樣量10 μL；體積流速1 mL/min；檢測波長333 nm；溫度35 ℃；得色譜圖1。

圖1 不同種、不同生長期肉蓯蓉樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取1，5，10，15和18 μL 1.3.1小節(jié)的對(duì)照品溶液，按1.3.3小節(jié)的色譜條件分別進(jìn)樣，測定色譜峰峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）對(duì)峰面積（Y，mA）進(jìn)行線性擬合，得苯乙醇苷類線性回歸方程，見表2。

1.3.4.2 精密度試驗(yàn)

將1.3.1小節(jié)的對(duì)照品溶液按1.3.3小節(jié)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，按1.3.4.1小節(jié)的回歸方程計(jì)算松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷和2-乙?；蠖∠惴榆蘸浚琒RSD值分別為1.78%，3.74%，1.18%和1.15%，表明儀器精密度良好。

1.3.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按1.3.2小節(jié)的方法制備6份平行樣品S2a溶液，按1.3.3小節(jié)的色譜條件進(jìn)樣，記錄樣品峰面積，按1.3.4.1小節(jié)的回歸方程計(jì)算松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷和2-乙?；蠖∠惴榆蘸?，SRSD值分別為0.83%，1.49%，1.20%和18.72%。除2-乙?；蠖∠惴榆?，其他3個(gè)苯乙醇苷試驗(yàn)重復(fù)性良好。

1.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.3.2小節(jié)的方法制備供試品溶液，按1.3.3小節(jié)的色譜條件依次在0，2，4，6，12，24和48 h進(jìn)樣10μL，記錄樣品峰面積，按1.3.4.1小節(jié)的回歸方程計(jì)算松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷、2-乙?；蠖∠惴榆蘸?，SRSD值分別為1.38%，0.96%，0.90%和11.78%。松果菊苷、肉蓯蓉苷和毛蕊花糖苷48 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取編號(hào)S2a肉蓯蓉粉末樣品3份，各1.0 g，精密稱量松果菊苷和肉蓯蓉苷A標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確吸取毛蕊花糖苷和2-乙?；蠖∠惴榆諏?duì)照品儲(chǔ)備液，各標(biāo)準(zhǔn)品加入量為肉蓯蓉樣品測得量的0.8，1.0和1.2倍。試驗(yàn)按1.3.2小節(jié)的方法制備供試品溶液，將新鮮制備的供試品溶液按1.3.3小節(jié)的液相色譜條件進(jìn)樣，按1.3.4.1小節(jié)的回歸方程計(jì)算含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷、2-乙?；蠖∠惴榆盏钠骄厥章史謩e為92.60%，98.34%，93.26%和91.21%，SRSD分別為4.04%，4.36%，2.71%和1.41%，加樣回收率良好。

1.3.5 含量測定

按1.3.2小節(jié)的方法制備供試品溶液，將新鮮制備的供試品溶液按1.3.3小節(jié)注入高效液相色譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

以不同種、產(chǎn)地、生長期的肉蓯蓉為研究對(duì)象，通過對(duì)苯乙醇苷類含量的測定可以看出（表3），不同種、產(chǎn)地、生長期肉蓯蓉苯乙醇苷類含量存在顯著差異。分類整理表3含量結(jié)果，得表4。新疆管花肉蓯蓉花期前松果菊苷（16.040 mg/g）、毛蕊花糖苷（3.714 mg/g）、2-乙?；蠖∠惴榆眨?.398 mg/g）的含量較荒漠肉蓯蓉高；內(nèi)蒙荒漠肉蓯蓉花期前各苯乙醇苷含量均較新疆荒漠肉蓯蓉的高；內(nèi)蒙荒漠肉蓯蓉3個(gè)生長時(shí)期苯乙醇苷含量差異情況為：松果菊苷含量，花期前＞吸器＞花期；肉蓯蓉苷A，吸器＞花期前＞花期；毛蕊花糖苷，花期前＞花期＞吸器；2-乙酰基洋丁香酚苷，花期＞花期前＞吸器。

表4 肉蓯蓉屬不同種、不同產(chǎn)地和不同生長期苯乙醇苷總平均含量測定結(jié)果

3 討論

產(chǎn)地、品種及生長期對(duì)肉蓯蓉苯乙醇苷類含量的影響一直是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題[25]。研究證明，松果菊苷和毛蕊花糖苷以內(nèi)蒙古產(chǎn)肉蓯蓉含量最高[26-27]，與試驗(yàn)結(jié)果一致，試驗(yàn)測定內(nèi)蒙古荒漠肉蓯蓉花期前松果菊苷和毛蕊花糖苷平均含量分別為4.50 mg/g和1.25 mg/g。王雪媛等[20]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古肉蓯蓉春季、秋季樣品中有效成分波動(dòng)差異較大，春季采收期肉蓯蓉松果菊苷和毛蕊花糖苷平均含量分別為3.26±0.83 mg/g和8.95±1.52 mg/g，秋季采收期肉蓯蓉松果菊苷和毛蕊花糖苷平均含量分別為3.16±0.34 mg/g和0.31±0.04 mg/g。春季采收期松果菊苷和毛蕊花糖苷測定的含量均高于試驗(yàn)花期前測定的值。據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測，不同生長期肉蓯蓉中苯乙醇苷類含量差異顯著，這可能與不同采收期環(huán)境中生態(tài)因素（如土壤溫度、空氣溫度、空氣濕度、光合有效輻射等）會(huì)發(fā)生不同程度的變化等有關(guān)[28]。馮潔等[25]研究發(fā)現(xiàn)甘肅產(chǎn)肉蓯蓉春季采收時(shí)苯乙醇苷含量最高。除了產(chǎn)地、品種、生長期對(duì)肉蓯蓉苯乙醇苷類含量有影響，試驗(yàn)操作過程中的提取溶劑濃度和提取時(shí)間也對(duì)測定結(jié)果有影響?？疾旒状继崛舛群吞崛r(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果見圖2和圖3。從圖2可以看出，甲醇最佳提取體積分?jǐn)?shù)為80%，從圖3中可以看出，超聲時(shí)間為40 min，提取效率最佳。在穩(wěn)定性試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)中，2-乙酰基洋丁香酚苷測定結(jié)果誤差大，是由于2-乙?；蠖∠惴榆辗€(wěn)定性較差，2 h后易降解，并且所選批次樣品中2-乙酰基洋丁香酚苷含量較低，接近定量限，導(dǎo)致測量誤差較大。

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苯乙醇苷提取效率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)苯乙醇苷提取效率的影響

由表4含量測定結(jié)果作圖4，同產(chǎn)地同生長期不同批次的管花肉蓯蓉、荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷類含量也有差異。一方面，其可能是生長年限和試驗(yàn)樣本基數(shù)小造成的，市面上購買的同一生長期的肉蓯蓉年限不同，造成苯乙醇苷含量差異大，另一方面，肉蓯蓉個(gè)體大小不一，同一批次樣本基數(shù)小，均一性差，也是造成同產(chǎn)地不同批次苯乙醇苷含量差異大的一重要原因。

圖4 同產(chǎn)地、同生長期的不同批次肉蓯蓉苯乙醇苷含量對(duì)比圖

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地、不同生長期的管花肉蓯蓉和荒漠肉蓯蓉進(jìn)行4個(gè)主要苯乙醇苷化合物的含量測定。結(jié)果表明，同一生長期新疆管花肉蓯蓉的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量較內(nèi)蒙古荒漠肉蓯蓉的高，內(nèi)蒙古產(chǎn)荒漠肉蓯蓉花期前各苯乙醇苷含量均較新疆產(chǎn)荒漠肉蓯蓉的高；內(nèi)蒙古荒漠肉蓯蓉3個(gè)生長時(shí)期苯乙醇苷含量差異情況：松果菊苷，花期前＞吸器＞花期；肉蓯蓉苷A，吸器＞花期前＞花期；毛蕊花糖苷，花期前＞花期＞吸器；2-乙?；蠖∠惴榆眨ㄆ冢净ㄆ谇埃疚?。綜合分析，內(nèi)蒙古產(chǎn)荒漠肉蓯蓉花期前的苯乙醇苷種類和含量較為豐富，松果菊苷平均含量為4.503 4 mg/g，肉蓯蓉苷A平均含量為2.029 5 mg/g，毛蕊花糖苷平均含量為1.250 3 mg/g，2-乙酰基洋丁香酚苷平均含量為0.398 8 mg/g。試驗(yàn)表明不同種、產(chǎn)地和生長期肉蓯蓉苯乙醇苷類含量差異顯著，可為肉蓯蓉后續(xù)質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥材使用提供試驗(yàn)依據(jù)。