骨橋蛋白聯(lián)合共軛亞油酸組合物增強免疫力的功能

崔東影，劉洋，蔣士龍，郭曉雅，劉瑩，解慶剛

黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司（北京 100015）

骨橋蛋白（OPN）由300個氨基酸組成，是一種多功能蛋白，在人乳中含量很高，占人乳中總蛋白質(zhì)含量的10%以上[1-2]，可在多種器官和組織表達(dá)，而且具有不同的生物學(xué)特性[3]，能夠參與機體多種生物學(xué)活動，如細(xì)胞增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)功能。其包含整聯(lián)蛋白和CD44結(jié)合位點，并通過結(jié)合其在細(xì)胞膜上的受體來發(fā)揮多種功能，從而參與各種細(xì)胞信號的傳導(dǎo)路徑。它由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。在細(xì)胞模型、動物模型和隨機臨床試驗中都對OPN進(jìn)行過研究。研究表明，其在腸道增殖和成熟[4-5]，腦髓鞘形成[6-7]，神經(jīng)發(fā)育[8-9]及免疫發(fā)育中起著重要作用。

共軛亞油酸（CLA）于1985年被發(fā)現(xiàn)，是必需脂肪酸亞油酸的異構(gòu)體，存在于哺乳動物組織中的CLA直接來自飲食，或者少量來自胃腸道微生物群落。CLA是源自動物脂肪組織和乳制品的食物的天然成分，由脂質(zhì)在肝臟生物氫化去飽和形成。由于衍生物眾多，已發(fā)現(xiàn)同分異構(gòu)體20余種，其中碳鏈雙鍵在9，11和10，12的同分異構(gòu)體含量最高、生理活性較強[10-11]。與許多其他多不飽和脂肪酸（PUFA）及其代謝物一樣，膳食CLA被提議作為開發(fā)新型食品和營養(yǎng)干預(yù)的重要手段[12]。共軛亞油酸有多種有益的生理功能，如減肥、防癌、增強免疫功能、降低身體炎癥[13-14]。近年來，其對宿主健康和身體疾病的影響成為關(guān)注熱點[15-17]。

試驗創(chuàng)新性地探究共軛亞油酸加入后，對于骨橋蛋白免疫功能的增強作用。由于該組合應(yīng)用尚屬首次，其功能未被驗證，通過相應(yīng)免疫試驗驗證組合功效，為其后續(xù)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)的研究支持。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

骨橋蛋白（Arla Foods Ingredients Group P/S，Lacprodan OPN-10）；共軛亞油酸甘油酯[巴斯夫（中國）有限公司，Tonalin?TG 80]。

1.2 試驗動物

試驗選用18～20 g SPF級KM種雌性小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號SCXK（京）2014-0004）。飼養(yǎng)期間給予自由采食基礎(chǔ)飼料和飲水。維持室內(nèi)溫度23±2 ℃、濕度40%～70%、12 h晝夜循環(huán)采光，其他操作嚴(yán)格遵守鼠房規(guī)范。

1.3 儀器與試劑

T1000電子天平、BS223S電子天平（德國Sartorius公司）；UV2600紫外可見分光光度計（上海萊睿科學(xué)儀器有限公司）；103-137螺旋測微儀（96099，日本三豐）；HH-M4恒溫水浴鍋（江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司）；GHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

Hank’s液（pH 7.2～7.4）、補體（豚鼠血清）、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；血紅蛋白（Hb）稀釋液試劑盒（南京建成生物工程研究所）；綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC，上海源葉生物科技有限公司）；二硝基氟苯、刀豆蛋白A（美國Sigma公司）；生理鹽水、SA緩沖液（碧云天生物科技有限公司）。

1.4 試驗動物及分組

試驗遵循《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中關(guān)于增強免疫力評價的評價辦法，小鼠經(jīng)過3 d適應(yīng)后正式開始試驗，100只小鼠隨機分為5組：空白對照組，OPN組，CLA組，OPN+CLA低、高劑量組，每組各20只小鼠。5組大鼠按表1進(jìn)行灌胃。小鼠灌胃劑量為10 mL/（kg bw），每天1次，連續(xù)30 d，末次給藥后進(jìn)行后續(xù)項試驗。

表1 各組小鼠攝入量表

1.5 試驗方法

1.5.1 小鼠免疫器官臟體比值測定

小鼠處死后，快速取下其脾臟組織和胸腺組織，小心剝離除去外周的結(jié)締組織，用濾紙吸干組織表面血漬，置于分析天平測量脾臟和胸腺的質(zhì)量，按式（1）計算小鼠免疫器官指數(shù)。

1.5.2 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗

給藥30 d后，小鼠處死后無菌去脾，小心輕揉磨碎脾臟，制備得3×106個細(xì)胞/mL的混懸液，取24孔板，試驗孔每孔加75 μL ConA（終濃度7.5 μg/mL）+1.0 mL細(xì)胞懸液，對照孔每孔加75 μL無菌水+1.0 mL細(xì)胞懸液，3～5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，按式（2）計算淋巴細(xì)胞的增殖能力[18]。

式中：AConA表示ConA誘導(dǎo)的吸光度；A無ConA表示無ConA誘導(dǎo)的吸光度。

1.5.3 NK細(xì)胞活性測定

無菌取脾，制成2×107個細(xì)胞/mL的單細(xì)胞懸液，用作效應(yīng)細(xì)胞。收集對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞，制成4×105個細(xì)胞/mL的單細(xì)胞懸液，用作靶細(xì)胞。參照文獻(xiàn)方法計算NK細(xì)胞活性（%）[19]。

1.5.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）試驗

取羊血，用生理鹽水洗滌，收集綿羊紅細(xì)胞，用生理鹽水配成2%（V/V）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL，經(jīng)過4 d致敏處理，對左后足跖部厚度進(jìn)行測定。采用20 μL 20%（V/V，用生理鹽水配制）SRBC懸液在測量部位進(jìn)行皮下注射，注射24 h后測量左后足跖部厚度。以上測量均為同一部位3次測量的平均值。DTH的程度用攻擊前后足跖厚度的差值表示。

1.5.5 抗體生成細(xì)胞數(shù)的測定

取羊血并用生理鹽水洗滌，收集綿羊紅細(xì)胞。用生理鹽水配成2%（V/V）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行免疫。采用Jerne改良玻片法檢測抗體生成細(xì)胞，并統(tǒng)計溶血空斑數(shù)。可反映抗體生成的細(xì)胞數(shù)用空斑數(shù)與全脾細(xì)胞的比值表示[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，采用Statview statistics軟件進(jìn)行Student’s t-test and one-way ANOVA檢驗，當(dāng)P＜0.05時判斷為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠免疫器官臟體比值

各組小鼠免疫器官臟體比值見表2。

表2 受試樣品對小鼠臟/體比值的影響（±S）

表2 受試樣品對小鼠臟/體比值的影響（±S）

組別 動物數(shù)/只 脾/體 胸腺/體A 10 4．2±0．7 3．8±0．4 B1 10 4．4±0．9 3．8±0．3 B2 10 4．5±0．6 3．9±0．4 C 10 5．0±0．8 4．3±0．6 D 10 4．6±1．1 4．0±0．7注: 各組與空白組比較P＞0．05。

免疫器官的發(fā)育直接反映機體的免疫情況，脾臟和胸腺作為機體重要的免疫中樞，是T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化、發(fā)育和成熟的主要場所[20-21]，也是機體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，因此脾臟和胸腺指數(shù)能夠反映機體免疫能力。試驗期間，各組小鼠試驗狀態(tài)良好，從表2可知，與空白對照組相比，各組別小鼠的肝臟和胸腺指數(shù)升高，差異不顯著，OPN+CLA低劑量組合物對小鼠的免疫器官增長具有一定促進(jìn)作用，可以提高大鼠的免疫器官指數(shù)，但由于后期小鼠體重的上升及各免疫器官重量趨于穩(wěn)定，導(dǎo)致上升趨勢不明顯。

2.2 各受試物對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

脾臟是T、B淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答場所，其淋巴細(xì)胞的增殖分化反應(yīng)著機體免疫能力的強弱。ConA能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化，使細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期（DNA合成前期），進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞活化增殖[22-23]，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗?zāi)壳耙呀?jīng)成為研究免疫調(diào)節(jié)的常用方法，也是反映機體細(xì)胞免疫狀況的基本指標(biāo)，淋巴細(xì)胞抵抗外界抗原刺激的增殖能力反映細(xì)胞免疫功能的強弱[24]。

從表3可知，與空白對照組相比，OPN、CLA單組分細(xì)胞的增殖能力不顯著（P＞0.05），OPN+CLA組可顯著提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.05）。OPN配伍CLA組相比較于單組分能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），并且隨著CLA劑量的增加作用效果更加明顯。結(jié)果表明，骨橋蛋白和共軛亞油酸組合可顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，且效果優(yōu)于單個組分。

表3 受試樣品對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（±S，n=10）

表3 受試樣品對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（±S，n=10）

組別 淋巴細(xì)胞增殖能力 (ΔA)A 0．035±0．004 B1 0．051±0．008 B2 0．052±0．008 C 0．090±0．015**D 0．106±0．010***注: *與空白對照組比較P＜0．05; **與空白對照組比較P＜0．01;***與空白對照組比較P＜0．001。

2.3 各受試物對小鼠NK細(xì)胞活性測定的影響

NK細(xì)胞是機體天然的免疫細(xì)胞，具有迅速免疫防御的生理功能，可分泌大量的免疫因子參與特異性的調(diào)控，也是聯(lián)系天然免疫與特異性免疫間的重要橋梁。由表4可知，與空白對照組相比，OPN組、CLA組均能提高小鼠NK細(xì)胞活性，但無顯著性差異，OPN+CLA高劑量組能顯著提高小鼠NK細(xì)胞活性（P＜0.05），促進(jìn)機體免疫功能。

表4 受試樣品對NK細(xì)胞活性測定的影響（±S，n=10）

表4 受試樣品對NK細(xì)胞活性測定的影響（±S，n=10）

組別 NK細(xì)胞活性/%A 26．68±1．21 B1 29．11±2．06 B2 30．37±1．60 C 31．20±6．10 D 32．74±1．75*注: *與空白組比較P＜0．05。

2.4 各受試物對綿羊紅細(xì)胞（SRBC）誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

遲發(fā)型超敏反應(yīng)是由特異性致敏效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的一種細(xì)胞免疫應(yīng)答，可反映機體特異性細(xì)胞免疫力的大小[25-26]。結(jié)果顯示（表5），與空白對照組比較，OPN、CLA組能顯著提高小鼠足跖增厚程度（P＜0.01），OPN+CLA低、高劑量組能極顯著提高小鼠足跖增厚程度（P＜0.001）。OPN+CLA組與OPN、CLA組比較均能顯著提高小鼠足跖增厚程度（P＜0.05），說明OPN+CLA組合物可以提高細(xì)胞免疫和對機體對特異性抗原的免疫能力。

表5 受試樣品對綿羊紅細(xì)胞（SRBC）誘導(dǎo)小鼠DTH的影響（±S，n=10）

表5 受試樣品對綿羊紅細(xì)胞（SRBC）誘導(dǎo)小鼠DTH的影響（±S，n=10）

組別 足跖厚度差值/mm A 0．574±0．065 B1 0．781±0．052**B2 0．871±0．037**C 1．062±0．065***^D 1．096±0．110***^注: *與空白對照組比較P＜0．05; **與空白對照組比較P＜0．01; ***與空白對照組比較P＜0．001; ^與B1、B2組相比P＜0．05。

2.5 各受試物對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

抗體生成細(xì)胞的數(shù)量主要反映淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，在一定程度上反映體液免疫能力的強弱。通過分光光度法檢測抗體形成細(xì)胞數(shù)量，從而反映脾臟淋巴細(xì)胞合成抗體的能力。OPN、CLA與空白組比較不能顯著提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)，OPN+CLA的組合物與空白對照組比較，能顯著提高小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)（P＜0.001，表6），提高小鼠對特異性抗原的應(yīng)答能力，并且隨著CLA劑量的提高，抗體生成細(xì)胞數(shù)逐漸增加。

表6 受試樣品對抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響（±S，n=10）

表6 受試樣品對抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響（±S，n=10）

組別 溶血空斑數(shù) (×103/全脾)A 121．20±6．45 B1 141．05±11．62 B2 135．90±12．70 C 159．80±12．13*D 185．91±15．74***^^注: *與空白對照組比較P＜0．05, **與空白對照組比較P＜0．01, ***與空白對照組比較P＜0．001; ^與B1、B2組相比P＜0．05, ^^與B1、B2組相比P＜0．01。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對免疫功能的評估主要是從非特異性免疫和特異性免疫兩方面入手，其中前者主要依靠機體固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等進(jìn)行調(diào)節(jié)，后者則分為細(xì)胞免疫和體液免疫，分別通過T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)揮作用。因此一些針對免疫驗證的評價主要也是依據(jù)這4個方面展開的[27]。試驗以脾淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞活性、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、血清溶血素生成試驗評價骨橋蛋白和共軛亞油酸組合后對機體免疫功能的影響。

試驗結(jié)果顯示，喂養(yǎng)期間，各組小鼠體況良好，無不良表現(xiàn)，說明組合物對健康小鼠均無不良反應(yīng)。骨橋蛋白配伍共軛亞油酸，能夠在提高脾淋巴細(xì)胞增殖能力、小鼠足跖增厚程度、血清溶血空班數(shù)和NK細(xì)胞活力上發(fā)揮作用。由此可見，該組合確實能夠在一定范圍增強機體免疫力，且作用機理初步估算是以增強脾臟淋巴細(xì)胞的增殖及特異性抗原的免疫能力為主調(diào)控細(xì)胞免疫，以調(diào)節(jié)血清溶血素的生成水平及增強非特異性免疫中NK細(xì)胞殺傷活性為輔作用體液免疫。

從特異性免疫來看，T淋巴細(xì)胞作為在脾臟發(fā)育成熟的免疫細(xì)胞，在機體免疫應(yīng)答過程中起到十分重要的作用。也是作為衡量機體細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)，因此常用脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率來評價機體細(xì)胞免疫力，若轉(zhuǎn)化率高，則表明免疫力增強[28]。骨橋蛋白是由多種機體細(xì)胞合成的多功能蛋白，參與和細(xì)胞信號傳導(dǎo)、遷移和附著的相互作用。在免疫系統(tǒng)中，骨橋蛋白是T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞經(jīng)激活后分泌的細(xì)胞因子[29-31]。而共軛亞油酸作為重要脂肪酸，其能通過促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞膜上的受體表達(dá)來參與機體細(xì)胞免疫的調(diào)控。研究顯示，在ConA等抗原的誘導(dǎo)下，隨著共軛亞油酸劑量的增加，淋巴細(xì)胞的分化率逐漸提高。此外，也有研究指出，其能通過增強巨噬細(xì)胞的活性及T細(xì)胞的分化等調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。因此動物在給予該組合物30 d后可見脾淋巴細(xì)胞的增殖和對特異性抗原的識別能力增強。同時T細(xì)胞的增殖，還能幫助機體B淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化產(chǎn)生抗體、分泌免疫因子[32-33]，由此介導(dǎo)體液免疫生成抗體細(xì)胞。

從非特異性免疫來看，該組合物能提高NK細(xì)胞活性，而NK細(xì)胞是天然的免疫功能細(xì)胞，不斷對機體進(jìn)行免疫監(jiān)視和免疫清除，作用范圍遠(yuǎn)大于T細(xì)胞，即使在無外界抗原刺激下，也能進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，維護(hù)機體正常運轉(zhuǎn)。同時多種試驗數(shù)據(jù)表明，共軛亞油酸能在促進(jìn)巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞活性，增加抗體的合成等方面起到免疫調(diào)節(jié)作用[34-36]。這也是試驗骨橋蛋白和共軛亞油酸組合調(diào)控非特異性免疫的主要機理。

綜上，骨橋蛋白和共軛亞油酸能夠協(xié)同發(fā)揮調(diào)控免疫作用，兩者結(jié)合能夠提高機體的免疫力。試驗結(jié)果也為功能性蛋白及脂肪酸類成分的組合應(yīng)用和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，展示新的研究思路。