殼聚糖復(fù)合涂膜對(duì)冷藏青蝦鹽煮熟制品質(zhì)的影響

齊懿涵，楊晉一，倪榮，馬曉璐，張振，李丹丹

1. 錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）；2. 錦州醫(yī)科大學(xué)生物信息工程學(xué)院（錦州 121000）

青蝦學(xué)名日本沼蝦又稱河蝦、草蝦，隸屬長(zhǎng)臂蝦科，沼蝦屬，對(duì)生活環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)[1]，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦。因其肉質(zhì)滑嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，已成為眾多淡水蝦中最具發(fā)展前途的種類之一。

青蝦生理生化、形態(tài)性狀、貯藏保鮮、腐敗機(jī)理等方面受到廣泛關(guān)注[2-3]。隨著人們生活品質(zhì)的提升和青蝦銷售量的上漲，其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)也逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。蝦類等水產(chǎn)品的貯藏方式仍以鮮銷和冷凍處理為主。而天然、安全的生物保鮮技術(shù)作為一種新興研究領(lǐng)域成為食品行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。生物保鮮劑是利用本身具有的抗菌、抗氧化等特點(diǎn)，對(duì)食品發(fā)揮保鮮作用從而達(dá)到防止腐敗污染的目的[5]。近幾年，生物保鮮技術(shù)得到廣泛關(guān)注，尤其側(cè)重對(duì)于殼聚糖、多酚類物質(zhì)的研究[6]。

蝦的鹽煮加工是深加工開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的基礎(chǔ)[7]。鹽煮熟制加工方式會(huì)對(duì)水產(chǎn)品的感官品質(zhì)、食用品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均具有影響[8]。很少關(guān)于生物保鮮劑涂膜貯藏對(duì)熟制樣品品質(zhì)影響的研究。然而蝦肉中富含大量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的降解直接影響蝦肉的變質(zhì)與新鮮程度[9]。因此，關(guān)于蝦類品質(zhì)的討論，對(duì)其蛋白質(zhì)生理生化特性的研究是必不可少的。為更加客觀地對(duì)青蝦食用品質(zhì)進(jìn)行量化評(píng)定，以冷藏青蝦為研究對(duì)象，將其進(jìn)行殼聚糖復(fù)合涂膜貯藏處理并按照傳統(tǒng)家庭鹽煮烹飪方式，分別檢測(cè)其可食部分的蛋白質(zhì)含量、持水性、巰基含量、SDS-聚丙酰胺凝膠電泳及肌肉微觀結(jié)構(gòu)的變化；探究涂膜保鮮貯藏的方式對(duì)青蝦在可食用狀態(tài)下的營(yíng)養(yǎng)成分的影響，旨在了解生物保鮮劑使青蝦貨架期延長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)食用營(yíng)養(yǎng)特征的影響，為青蝦的合理開(kāi)發(fā)利用及加工貯藏提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青蝦（大小均勻，一級(jí)鮮度，顏色鮮亮，購(gòu)買于錦州市林西路市場(chǎng)）。

殼聚糖（分子量161.16 kDa，脫乙酰度＞95%，黏度100～200 mPa·s，食品級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；ε-聚賴氨酸（食品級(jí)，山東欣鼎生物科技有限公司）；卡拉膠（河南洪鑫食化有限公司）；冰乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；牛血清蛋白、SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G-250、DTNB、Tris-HCl緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī)（北京大龍儀器裝備有限公司）；BCD-178TMPD冰箱（海爾集團(tuán)）；Varioskan FlashT酶標(biāo)儀；SDS-PAGE凝膠電泳儀（美國(guó)BIO-RAD）；FD-1B-80冷凍干燥機(jī)（上海葉拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；S-4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將青蝦洗凈，置于冰水中冷凍致死后隨機(jī)分為3組備用，并按照前期研究結(jié)果制備涂膜液[10]。涂膜液配比如表1所示。

表1 各組涂膜液的配比

將3組樣品分別放置于A組、B組、C組保鮮劑中浸泡10 min后取出，自然瀝干水分后裝入無(wú)菌PE保鮮袋中，放入4±1 ℃的冷藏冰箱內(nèi)進(jìn)行貯藏。

1.2.2 鹽煮

將上述樣品洗凈，置于鹽度20%微沸鹽水中，轉(zhuǎn)至大火鹽煮5 min，取出冷卻并去除蝦殼、蝦頭、蝦線等，留可食部分為備用試驗(yàn)原料進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定[11]。

1.2.3 肌原纖維蛋白的提取

參照Park等[12]的方法略作修改。取搗碎的蝦肉5 g，加入20 mL PBS緩沖液（10 mmol/L），混合分散均勻。在4 ℃條件下以5 000 r/min離心30 min，棄上清，在沉淀中加入3倍體積冰的NaCl溶液，重復(fù)3次，在最后一次離心前將沉淀用4層紗布過(guò)濾，去除結(jié)締組織，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)鹽溶性測(cè)定

參考《蛋白質(zhì)含量測(cè)定-考馬斯亮藍(lán)法》進(jìn)行測(cè)定[13]。于酶標(biāo)儀OD595中進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 蛋白質(zhì)持水性的測(cè)定

參照徐言等[11]的方法。稱取5 g（M1）鹽煮后的各組蝦肉樣品，稱量濾紙質(zhì)量為M3。將稱重后的濾紙包裹樣品置于離心管中，在4 ℃條件下以4 500 r/min離心15 min，取出后精確稱量離心后濾紙的質(zhì)量M2，參照式（1）計(jì)算持水性。

1.2.6 巰基含量測(cè)定

參考Benjakul等方法[14]，取1 mL經(jīng)1.2.3小節(jié)方法提取出的蛋白，加入0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液，取4 mL稀釋液，加入0.4 mL DTNB（10 mmol/L），經(jīng)40℃水浴25 min，在酶標(biāo)儀A412nm處測(cè)吸光度。SH含量（mol/105g Pro）計(jì)算見(jiàn)式（2）。

式中：a為吸光度；b為稀釋倍數(shù)；C為分子吸光系數(shù)，13 600 L/（mol·cm）；M為待測(cè)液濃度。

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參照Verrez-bagnis等[15]的方法進(jìn)行操作。取10 μL蛋白溶液，進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定電泳條件：濃縮膠過(guò)程電流恒定在70 V，分離膠電流恒定在100 V，等待溴酚藍(lán)顏色到達(dá)底部白色膠條處，停止電泳。將試驗(yàn)?zāi)z小心取出，分離膠全部放入染色液中染色2 h，使用脫色液去色，蛋白條帶清晰可見(jiàn)即可。

表2 分離膠和濃縮膠配比表

1.2.8 微觀結(jié)構(gòu)

參照李慢[16]的方法，割取鹽煮后的青蝦肌肉橫截面，浸泡在4 ℃的固定液中過(guò)夜。取出將樣品于PBS緩沖液中沖洗15 min，洗滌3次，然后將樣品分別在30%，50%，70%，90%和100%的乙醇溶液洗脫樣品15 min，重復(fù)2次。將樣品放入冷凍干燥機(jī)中過(guò)夜使肌肉脫水，待干燥完成后取出，將樣品放置在噴金涂布機(jī)（Eiko IB3，JEOL Ltd.，Tokyo，Japan）中處理5 min，并使用SEM（JSM-6390LV，JEOL Ltd.，Tokyo，Japan）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS和Excel 2013進(jìn)行分析和繪圖，以P＜0.05計(jì)為統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鹽溶性的變化

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以其含量為X軸，吸光度為Y軸，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。冷藏青蝦在不同涂膜處理?xiàng)l件下貯藏0～12 d，并分別進(jìn)行鹽煮加工后蛋白質(zhì)鹽溶性的變化情況如圖2所示。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 蛋白質(zhì)鹽溶性變化情況

與新鮮樣品相比，各組在進(jìn)行鹽煮加工后，蛋白含量均下有顯著下降。貯藏前8 d，各組的差異并不明顯，到8～12 d時(shí)各組差異性顯著（P＜0.05）。貯藏第12 d時(shí)，A組、B組、C組的蛋白質(zhì)鹽溶性分別為19.01，15.56和13.92 mg pro/g。與空白組進(jìn)行比較，可以看出涂膜貯藏的方式對(duì)鹽溶性的降低有效，而殼聚糖復(fù)合涂膜組的效果更為明顯，對(duì)蛋白鹽溶性的下降具有抑制作用。測(cè)定肌動(dòng)球蛋白鹽溶性的變化在一定程度上反映了肉蛋白質(zhì)的變性程度[17]。鹽煮加熱的高溫環(huán)境使蛋白質(zhì)過(guò)度水解，鹽溶性下降[18]。

2.2 蛋白質(zhì)持水性的測(cè)定

持水性反映了肌肉中滲出水分的多少，持水性低表示肌肉滲出水分少，說(shuō)明肌肉細(xì)胞組織的完整性較好[19]。不同涂膜貯藏的冷藏青蝦經(jīng)鹽煮后對(duì)樣品蛋白質(zhì)持水性的影響如圖3所示，新鮮樣品的鹽溶性蛋白溶出率低，結(jié)構(gòu)完整，因此新鮮組的蝦肉汁液滲出量最少，持水性最好。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦肉逐漸腐敗變質(zhì)，因此滲出的水分也逐漸增多。與空白組比較，在貯藏至第10天時(shí)復(fù)合組與空白組出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），表明殼聚糖復(fù)合涂膜組的蝦肉持水能力最強(qiáng)，第12天僅達(dá)13.04%；而空白組的蝦肉持水能力最低，12 d達(dá)到17.81%，說(shuō)明空白組腐敗程度最深，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，水分滲出最多。同時(shí)由于樣品經(jīng)過(guò)鹽煮熟制加工，會(huì)提高蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力，使整體的持水性有所提高[20]。

圖3 蛋白質(zhì)持水性的變化

2.3 巰基含量的測(cè)定

不同生物保鮮劑對(duì)冷藏青蝦鹽煮后的巰基的含量變化如圖4所示。在不同涂膜處理下貯藏12 d的樣品與新鮮樣品相比巰基含量均有顯著下降（P＜0.05）。空白組的樣品的巰基含量經(jīng)過(guò)貯藏12 d后從新鮮的8.41 mol/g下降至7.91 mol/g，而殼聚糖復(fù)合涂膜和殼聚糖單一涂膜的樣品分別下降至8.32和8.17 mol/g，經(jīng)差異性分析可得不同涂膜處理對(duì)鹽煮青蝦肌動(dòng)球蛋白巰基含量有顯著影響。并且殼聚糖復(fù)合涂膜組巰基含量高于其余組，下降速度最慢。

圖4 貯藏期間蛋白巰基含量變化情況

巰基（-SH）是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和保持相對(duì)酶活性的重要基團(tuán)，在生物體內(nèi)極易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生二硫鍵，從而導(dǎo)致體內(nèi)總巰基含量的下降。熱加工處理會(huì)使樣品中的巰基含量降低，這是由于加熱會(huì)破壞肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，巰基發(fā)生轉(zhuǎn)移，活性巰基增加，甚至發(fā)生氧化反應(yīng)，生成二硫鍵和聚集體，因此巰基的質(zhì)量摩爾濃度降低[21]。這也是經(jīng)鹽煮后的樣品巰基含量相對(duì)較低的原因。

2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE利用不同物質(zhì)的電荷和分子量不同的特點(diǎn)，將生物大分子進(jìn)行分離從而達(dá)到鑒定蛋白質(zhì)分子量的目的，這種方式也可用于評(píng)估樣品在貯藏過(guò)程中的蛋白質(zhì)變化規(guī)律。樣品的分子量大致分布于11～180 kDa。肌原纖維蛋白約占蝦體總蛋白的50%～70%，是蛋白質(zhì)中的重要組成部分。其中，肌球蛋白（約200 kDa）、肌動(dòng)蛋白（約45 kDa）、原肌球蛋白（約38 kDa）、肌球蛋白輕鏈（17～23 kDa）均屬于肌原纖維蛋白且在電泳圖譜條帶中清晰可見(jiàn)[22]。

冷藏青蝦在不同涂膜處理?xiàng)l件下貯藏12 d后，將其進(jìn)行鹽煮加工后的蛋白的凝膠電泳圖譜如圖5所示，相比于新鮮樣品，隨著貯藏時(shí)間達(dá)到12 d時(shí)，另外3組條帶均出現(xiàn)較明顯的變淺情況，寬度縮減；A組、B組的電泳條帶較深，與新鮮樣品更為相似。C組的變化程度更大，肌原纖維蛋白條帶亮度明顯低于新鮮樣品和涂膜組，可能是因?yàn)榕c其他的蛋白相比較，空白組的蛋白更容易發(fā)生降解。可以說(shuō)明，殼聚糖復(fù)合組蛋白降解的速度較慢，空白組降解蛋白的速度最快。

圖5 SDS-PAGE圖譜

2.5 微觀結(jié)構(gòu)

冷藏青蝦在不同涂膜處理?xiàng)l件下貯藏12 d后經(jīng)鹽煮加工肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)如圖6所示，不同組蝦肉的組織結(jié)構(gòu)顯著不同。新鮮樣品的表面松散均勻，排列緊密，無(wú)明顯纖維斷裂情況，僅有較少縫隙，整體的肌肉結(jié)構(gòu)比較完整。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在第12天時(shí)，復(fù)合組與新鮮組結(jié)構(gòu)相似，僅出現(xiàn)少量的顯微斷裂情況。而單獨(dú)組與空白組均出現(xiàn)一定程度的小片化。空白組的結(jié)構(gòu)小片化嚴(yán)重，出現(xiàn)嚴(yán)重的凝聚和交聯(lián)現(xiàn)象，肌纖維斷裂明顯。總體來(lái)說(shuō)，殼聚糖復(fù)合涂膜的作用較強(qiáng)于其他組，能夠在一定程度上抑制結(jié)締組織降解，防止肌肉質(zhì)地軟化。

圖6 鹽煮青蝦肌肉組織掃描電鏡圖

3 結(jié)論

以青蝦為研究對(duì)象，探究殼聚糖復(fù)合涂膜對(duì)冷藏青蝦鹽煮加工后肌肉蛋白特性的影響。結(jié)果表明：殼聚糖涂膜對(duì)青蝦鹽煮后蛋白質(zhì)鹽溶性、持水性及巰基含量均具有保持作用；電泳圖和微觀結(jié)構(gòu)圖也表明蛋白降解程度的差異。試驗(yàn)是前人涂膜處理對(duì)水產(chǎn)品貯藏期間肌肉蛋白品質(zhì)變化研究的有效補(bǔ)充和延伸，為蝦類品質(zhì)控制和蛋白質(zhì)表征新鮮度提供參考。