破壁靈芝孢子粉破壁率的測定

高志城，周敏，張任廣，蘇水嬌，寧禮信，黎子林

廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東省原位電離質譜分析工程技術研究中心（廣州 510070）

破壁靈芝孢子粉是開發較多的靈芝產品之一。研究表明，顯微鏡下破壁孢子粉與未破壁孢子粉的形態明顯不同，同時經過破壁處理后，靈芝孢子中的還原性糖和多肽等化學成分更容易被提取出來，破壁孢子粉的醇提取液也比未破壁孢子粉具有更強的體外抗腫瘤活性[1-3]。因此，破壁率也常被認為是衡量靈芝破壁孢子粉質量的重要指標之一[4-6]。靈芝孢子粉破壁率的檢測方法可分為血球計數法[7-8]、水裝片結合顯微技術法[9]、懸浮法結合物理技術[10-11]、化學指紋法[12]等。在“保健食品原料目錄 破壁靈芝孢子粉 破壁靈芝孢子粉原料技術要求/理化指標 1 破壁率的測定”的基礎上，改善相關試驗條件，進行對比試驗，建立一個適用于破壁靈芝孢子粉破壁率的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蔗糖（分析純，阿拉丁工業公司）；聚山梨酯-80（分析純，廣州化學試劑廠）。

1.1.2 主要儀器與設備

Olympus生物顯微鏡（CX23LEDRFS1C，奧林巴斯工業有限公司）；血球計數板（25個中格×16個小格，上海市求精生化試劑儀器有限公司）；超聲波振蕩器（AS3120型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科學儀器有限公司）；不銹鋼藥典篩6號；100 mL容量瓶。

1.2 樣品制備

分別取同一批次有代表性靈芝孢子粉和破壁靈芝孢子粉的樣品，各100 g，分別充分混勻，置于密閉的容器內。

1.3 樣品前處理

取適量同一批次的靈芝孢子粉A和破壁靈芝孢子粉B，于烘箱60 ℃烘干5 h。

準確稱取經烘干的孢子粉A1，A2和破壁靈芝孢子粉B1，B2，其中mA=0.100 0 g，mB=0.150 0 g。

對照組：分別稱取5.0 g經過研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末，分別與孢子粉A1、B1充分混合至色澤均一。用蒸餾水分別溶解上述樣品，在樣品溶液中加0.1 mL聚山梨酯-80，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，并在室溫超聲振蕩30 min，使孢子充分分散。

試驗組：分別稱取5.0 g經過3次重復研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末，分別與孢子粉A2、B2充分混合至色澤均一。用蒸餾水分別溶解上述樣品，在樣品溶液中加0.1 mL聚山梨酯-80，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，并在室溫超聲振蕩60 min，使孢子充分分散。

1.4 測定

1.4.1 進樣

將待測孢子懸液，用吸管吸取1滴置于蓋玻片的邊緣，使液體緩緩滲入，多余的液體用吸水紙吸取，進樣完成后靜置約30 s，將血球計數板置于400倍數的光學顯微鏡下進行觀察計數。

1.4.2 靈芝孢子粉

置于顯微鏡下觀察孢子呈卵圓形，頂端鈍圓或截形，如圖1所示。

圖1 靈芝孢子粉顯微形態（400倍）

1.4.3 破壁靈芝孢子粉

置于顯微鏡下觀察，孢壁多破碎，可見多數黃褐色的大小不等的微粒、孢子破碎程度不同的殼段或孢子破碎后里面的黃色至黃褐色的內容物，如圖2所示。

圖2 破壁靈芝孢子粉顯微形態（400倍）

1.4.4 觀察計數

使用25個中格×16個小格的計數板，如圖3所示，應計算出血球計數板4個角上與中央5個中格中含完整靈芝孢子的數目（即以80個小格為1個計數單位）[13-14]，每個樣品有效觀察計數不少于3次，計算它們的平均數n。

圖3 血球計數板計數區域圖

1.5 計算方法

使用25個中格×16個小格的計數板時，每克孢子粉中含完整靈芝孢子數按式（1）計算。

式中：N為每克孢子粉含完整的靈芝孢子數，個/g；n為80個小方格內含完整靈芝孢子的總數，個；V為孢子稀釋液的體積，mL；m為樣品的質量，g；400為血球計數板的計數室內共有400個小方格；10 000為血球計數板計數室的容積，為0.1 mm3，1 mL相當于10 000個血球計數板計數室的容積。

破壁率按式（2）計算。

式中：X為破壁靈芝孢子粉的破壁率，%；NB為每克破壁靈芝孢子粉中含完整的靈芝孢子數，個/g；NA為每克靈芝孢子粉中含完整的靈芝孢子數，個/g。

2 結果與分析

2.1 方法改變前結果

對樣品A1、B1分別有效觀察計數3次，計數結果見表1。靈芝孢子粉3次計數的平均值為99，相對標準偏差為10.25%；破壁靈芝孢子粉3次計數的平均值為3，相對標準偏差為21.65%；根據公式計算得出破壁率98%。

表1 方法改變前結果

2.2 方法改進后結果

對樣品A2、B2分別有效觀察計數3次，計數結果見表2。靈芝孢子粉3次計數的平均值為168，相對標準偏差為1.79%，破壁靈芝孢子粉3次計數的平均值為2，相對標準偏差為0.0%。根據公式計算得出破壁率99%。

表2 方法改進后結果

2.3 結果分析

試驗結果表明，由于孢子懸液分布不均勻，樣品A1、B1在原方法中與研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末混勻后超聲振蕩30 min，破壁率為98%，每次計數的5個視野得到的數值不平均，3次計數的總數的相對標準偏差較大，而樣品A2、B2在與經過3次研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末混勻后超聲振蕩60 min，破壁率為99%，每次計數的5個視野得到的數值相對平均，3次計數的總數的相對標準偏差有明顯降低，結果提高1%。

3 結論與討論

3.1 討論

為保證破壁率測試結果的準確性，因此對試驗人員和試驗用器具都有嚴格的要求。在實際檢驗過程中要注意幾點：一是鏡檢計數室。因前一次清洗不到位，或者保存過程中存在污染，更或者因操作不當導致的計數室存在劃痕，若不及時清洗或更換，則會對后期試驗計數產生極大影響。所以，在每次使用血球計數板之前都需要認真鏡檢計數室，如若在鏡檢時發現計數室有污物，則需按要求清洗并吹干后進行試驗[15]。二是搖勻后取液。在吸出孢子懸液進行計數之前，需輕輕振蕩試管，使孢子分布均勻，防止聚集沉淀，從而提高計數的代表性和準確性。三是掌握計數原則，并采用“計上不計下，計左不計右”的計數原則[16]。四是通過延長超聲振蕩時間，重復多次研磨蔗糖粉末來解決孢子懸液分布不均勻的問題，提高試驗的準確性。

3.2 結論

使用血球計數板的優點是試驗成本不高、操作簡單，適合于大批量、長期穩定的樣品的分析，是生產企業和檢驗機構的不錯的選擇。但是由于孢子懸液分布不均勻的不確定性，也存在重復性差、準確度較低、測得的平行樣的相對標準偏差大等缺點，試驗通過延長超聲振蕩的時間，重復多次研磨蔗糖粉末，使孢子懸液分布更加均勻，明確計數原則減少計數誤差，得到令人滿意的試驗結果。但尚有問題亟待解決：因為要將待測孢子懸液，用吸管吸取1滴置于蓋玻片的邊緣，使液體緩緩滲入，多余的液體用吸水紙吸取，在這個操作過程中容易造成氣泡的產生，容易導致每次取樣量不一致，導致結果存在誤差。后續研究的重點就是解決因氣泡產生造成的結果差異性的問題，簡化分析程序，提高檢測準確度，為實際檢測工作提供有效參考和數據支持。